可溶性Netrin-1受体对人滋养细胞株TEV-1增殖凋亡的影响

钟少平 沈华祥 刘霞 周晓宇 葛加美 彭华

●论 著

可溶性Netrin-1受体对人滋养细胞株TEV-1增殖凋亡的影响

钟少平 沈华祥 刘霞 周晓宇 葛加美 彭华

目的 观察可溶性Netrin-1受体对人滋养细胞增殖凋亡的影响，探究Netrin-1/Neogenin通路在滋养细胞凋亡过程中的机制。 方法 行早孕期滋养细胞株TEV-1培养，细胞预处理24h后，改用含不同浓度Neogenin的培养液，以浓度为0ng/ml的培养液为对照组，其余不同浓度Neogenin（1、5、10、50ng/ml）干预的培养液均为实验组。应用噻唑蓝（MTT）比色法、流式细胞术（FCM）检测细胞增殖指数、凋亡率；采用细胞免疫荧光法检测Netrin-1蛋白在TEV-1细胞内的表达，real-time PCR及Western印迹检测Netrin-1 mRNA及Netrin-1蛋白表达情况。 结果 不同浓度的Neogenin对TEV-1细胞增殖无明显影响，但TEV-1细胞凋亡率随Neogenin浓度的增加而增加。Netrin-1表达于滋养细胞胞质。实验组当Neogenin浓度达到50ng/ml时，TEV-1细胞表达Netrin-1 mRNA水平较对照组增加约40.38倍，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。Netrin-1蛋白表达情况受Neogenin浓度影响不明显（P＞0.05）。 结论 可溶性Netrin-1受体能促进TEV-1细胞凋亡及Netrin-1 mRNA表达，Netrin-1/Neogenin通路参与了TEV-1细胞凋亡过程。

可溶性受体 滋养细胞 增殖 凋亡

可溶性受体广泛存在于细胞外液中，作为相应膜受体的竞争者与配体进行结合，阻断配体信号的转导途径，影响细胞生物行为，在炎症发生、肿瘤血管形成等过程中起到重要作用[1-2]。Neogenin作为一种特异与Netrin-1结合的膜受体，广泛分布于机体神经、肌肉及上皮组织。当细胞外Netrin-1占据跨膜蛋白Neogenin胞外FC段的特异结合部位形成Netrin-1/Neogenin结合物后，通过Netrin-1/Neogenin通路进行信号传导，激活肌动蛋白，聚合呈纤丝状，使细胞膜生出丝状伪足样并延伸，参与神经、肌肉及腺体形成[3-4]。同时研究还发现，Neogenin可作为前凋亡因子诱导细胞凋亡[5]。杨昀等[6]研究表明 Netrin-1表达于滋养细胞，但 Netrin-1/ Neogenin通路是否介导滋养细胞凋亡过程仍有待研究。因此，我们通过可溶性Netrin-1受体，即人重组蛋白Neogenin胞外FC段，结合游离Netrin-1，检测细胞增殖、凋亡的行为变化，探究Netrin-1/Neogenin通路在滋养细胞生物学行为中的功能。

1 材料和方法

1.1 材料 人早孕绒毛外滋养细胞株TEV-1由香港大学George S.W.Tsao博士惠赠，此细胞系来源早孕绒毛膜绒毛，具有绒毛外滋养细胞的免疫学和生物学表型[7]。人重组蛋白Neogenin胞外FC段（美国Alexis公司），DMEM/F12细胞培养基、新生牛血清、二甲基亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT）（美国Gibco公司），兔抗人Netrin-1单克隆抗体及SABC-FITC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（珠海健康元生物医药有限公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），ReverTra Ace及SYBR Green real-time PCR master mix试剂盒（日本Toyobo公司），Lightcycler荧光480PCR扩增仪（德国Roche公司），SDS-PAGE凝胶试剂盒（武汉谷歌生物科技有限公司）。Netrin-1特异性引物的核苷酸序列如下：正义链：5′-TGGGGCGGTTGTCCTATTTC-3′，反义链：5′-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3′；β-actin特异性引物的核苷酸序列如下：5′-GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反义链：5′-CTGCTGTCACCTTCACCGTT-3′；以上序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法 将TEV-1细胞置于含15%新生牛血清的DMEM/F12培养液中，37℃、5%CO2培养，待细胞培养至对数生长期时，用0.25%胰酶消化液解离。预处理细胞：按5×103个/孔接种于96孔板上，每孔体积200μl，培养24h至细胞完全贴壁。改用含不同浓度（0、1、5、10、50ng/ml）的Neogenin无血清培养液，其中不含Neogenin（即0ng/ml）的培养液为对照组，添加浓度1、5、10、50ng/ ml的Neogenin培养液组为实验组。

1.3 MTT比色法检测 测定不同浓度Neogenin对TEV-1细胞增殖的影响。两组培养液根据不同药物浓度再分设3孔，并置于37℃、5%CO2的培养箱中24h，弃培养液，各孔加入20μl MTT，37℃孵育4h，弃上清液，再加入150μl DMSO温和振荡10min使结晶充分溶解、混匀，酶标仪（波长490 nm）测定各孔吸光度。

1.4 流式细胞术（FCM）检测 测定Neogenin对TEV-1细胞凋亡的影响。预处理时改用6孔板，以1×106个/孔细胞接种得到不同浓度Neogenin干预24h后的TEV-1细胞，0.01M PBS缓冲液洗涤1次，0.25%胰酶消化液解离各孔细胞，1 500r/min离心5min，弃上清液收集细胞，0.01M PBS缓冲液重新悬浮细胞并计数。取含2×105个细胞的悬浮液，1 500r/min离心5min，弃上清液收集细胞，依次加入1×结合缓冲液（Binding Buffer）500μl、膜联蛋白V（Annexin V）5μl及碘化丙啶（PI）10μl，轻轻混匀。在室温下避光反应10min，30min后用流式细胞仪检测，激发波长488nm，发射波长530nm，通过捕捉到Annexin V、PI发出的荧光组成细胞直方图，每个象限的点数及其占总点数的百分比即表示每种细胞的数目及所占细胞的百分比。在细胞直方图内的左上象限（Q1）、右上象限（Q2）、右下象限（Q3）及左下象限（Q4）分别代表损伤细胞、正常细胞、早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞，其中总凋亡率为早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞之和占所有细胞的百分比（Q2+Q4）。

1.5 细胞免疫荧光检测 检测TEV-1细胞表达情况。预处理时改用24孔板，以5×104个/孔细胞接种得到不同浓度Neogenin干预24h后的TEV-1细胞，弃培养基，0.01M PBS缓冲液洗涤2次，3min/次；4%多聚甲醛固定细胞15min，0.01M PBS缓冲液洗涤4次，3min/次。加入0.1%聚乙二醇辛基苯基醚150μl作用20min，0.01M PBS缓冲液洗涤2次，3min/次。加入正常血清（1∶10）封闭20min后甩干，兔抗人Netrin-1单克隆抗体（1∶100）4℃过夜，0.01M PBS缓冲液洗涤2次，3min/次。各孔加入与兔抗人Netrin-1单克隆抗体相对应的生物素化鼠抗兔IgG二抗（1∶100），置37℃恒温箱30min后用0.01M PBS缓冲液洗涤3次，2min/次。滴加用异硫氰酸荧光素标记的链霉亲和素复合体（1∶100），置37℃恒温箱30min后甩干，再加入PI 5.0μg/ml。20min后用0.01M PBS缓冲液洗涤5次，4min/次。置于荧光显微镜下以蓝光（波长488nm）激发后观察。

1.6 real-time PCR检测 检测TEV-1细胞Netrin-1 mRNA表达情况。同FCM处理。采用Trizol-氯仿-异丙醇一步法提取细胞总RNA，按试剂盒说明将mRNA逆转录成cDNA分子，应用SYBR Green染料技术行实时定量PCR反应。扩增条件：首轮变性95℃×2min；变性95℃×15s、退火72℃×30s、延伸72℃×45s，末轮延伸72℃× 10min，40个循环。样本扩增和数据的获得采用Roche荧光定量PCR仪，得到各浓度标本的曲线，分析Ct值。TEV-1细胞Netrin-1 mRNA表达值（待测目的基因起始拷贝数/内对照基因起始拷贝数）＝2-△△Ct；△△Ct＝△Ctβ-actin－△Ct待测样品；△Ct＝Ct待测样品－△Ct正常对照。

1.7 Western印迹检测 同FCM处理。采用全蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白质，行BCA法[8]测定蛋白浓度，各孔加入总蛋白质20μg，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至聚偏氟乙烯膜上，分别加入兔抗人Netrin-1单克隆抗体（1∶300）、鼠抗人β-actin单克隆抗体（1∶200），4℃孵育过夜。次日加入用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1∶3 000）或辣根过氧化物酶标记的IgG进行化学发光反应，结果曝光于医用X线胶片上。将胶片进行扫描，用凝胶图像分析系统处理图片条带光密度值（代表Netrin-1蛋白表达情况）。

1.8 统计学处理 采用SPSS12.0统计软件，实验数据用 表示，均数间比较采用F检验。

2 结果

2.1 不同浓度Neogenin对TEV-1细胞增殖的影响 经不同浓度Neogenin培养24h后，实验组TEV-1细胞吸光度依次为0.28±0.06、0.26±0.05、0.29±0.01及0.31±0.03，与对照组的0.23±0.01比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明Neogenin的浓度对TEV-1细胞增殖无明显影响。

2.2 不同浓度Neogenin对TEV-1细胞凋亡的影响 经不同浓度Neogenin培养24h后，实验组TEV-1细胞总凋亡率依次为（37.30±1.84）%、（38.65±4.45）%、（39.25± 9.40）%及（56.65±9.83）%。可见，TEV-1细胞凋亡率随Neogenin浓度的增加而增高，与对照组[（18.70±0.85）%]比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 不同浓度Neogenin干预24h后TEV-1细胞凋亡检测图（A：0ng/ml；B：1 ng/ml；C：5 ng/ml；D：10 ng/ml；E：50 ng/ml）

2.3 TEV-1细胞表达情况 细胞免疫荧光检测表明，TEV-1细胞的细胞膜及细胞质内出现黄绿色荧光（图2），细胞核被PI着色后呈现棕黄色荧光。未见其它明显非特异性荧光反应。

图2 兔抗人Netrin-1蛋白单克隆抗体对TEV-1细胞进行间接免疫荧光检测（A：×100倍；B：×200倍；C：×400倍）

2.4 TEV-1细胞Netrin-1 mRNA表达情况 real-time PCR检测发现，经不同浓度Neogenin培养TEV-1细胞24h后，实验组TEV-1细胞表达Netrin-1 mRNA水平较对照组有明显增加，其增加倍数依次为1.89±0.41、1.54±0.30、1.56±0.25、40.38±9.32。两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 TEV-1细胞Netrin-1蛋白表达情况 Western印迹检测结果显示，经不同浓度Neogenin培养TEV-1细胞24h后，实验组Netrin-1蛋白表达量依次为0.86±0.02、0.83±0.01、0.84±0.03及0.92±0.04，与对照组0.79±0.01比较未见明显增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

在探究神经发育过程中的未知蛋白时，Vielmetter等学者于1994年通过提取孕18d的鸡胚脑组织建立cDNA文库并对其进行研究，发现一种新物质——Neogenin，属结肠、直肠癌缺失基因家族成员，细胞外含有4个免疫球蛋白结构域、6个FN3区域及与Netrin-1特异结合的部位[3，9]。Neogenin广泛表达于脊椎动物胚胎神经、上皮及肌肉组织中，参与细胞分化、迁移及增殖等过程。作为胚胎神经前体细胞的特异性标记物，Neogenin还参与细胞的分化过程[10]，并且与Netrin-1特异性结合后促进神经新生及轴突形成[11]。Neogenin极性表达于成腔上皮细胞膜上，与相邻细胞特异性受体Netrin-1结合后通过Netrin-1/Neogenin通路诱导上皮细胞定向迁移、极性生长并互相黏附，从而形成完整的上皮结构[12-13]。

Park等[14]学者研究发现，与其它VEGF、PDGF等有丝分裂原一样，Netrin-1是一类具有较强促进血管新生作用的蛋白。它通过刺激内皮细胞增殖，诱导其迁移并黏附于血管平滑肌细胞，参与新生血管网络的构建。研究还发现，Netrin-1可促进脐带内皮细胞增殖及管腔形成[15]。本研究改用不同浓度的Neogenin培养液干预24h后，具有绒毛外滋养细胞特性的TEV-1细胞Netrin-1 mRNA表达量有所升高；当实验组Neogenin的浓度达到50ng/ml时，Netrin-1 mRNA水平较对照组增加40.38倍，两组间差异有统计学意义（P＜0.05）。另外，TEV-1细胞虽然能表达Netrin-1蛋白，但受Neogenin的浓度影响不明显，具体机制仍有待进一步研究。

体内存在的可溶性受体通常为膜受体的胞外段经水解释放的。目前，研究者常通过基因重组技术获得具有可溶性受体特性的人重组蛋白，作为相应膜受体的竞争者与配体进行结合，阻断配体的信号转导，影响细胞生物行为，在机体生命活动中起到重要作用。本研究发现，TEV-1细胞能表达Netrin-1蛋白起到维持细胞生长的作用。当培养基中Netrin-1与游离蛋白Neogenin胞外Fc段结合后，培养基中游离Netrin-1的浓度下降，使得TEV-1细胞的Netrin-1/Neogenin通路信号传导减弱，并通过反馈机制促进Netrin-1转录及翻译，最终导致Netrin-1 mRNA及Netrin-1蛋白水平升高。但由于Netrin-1蛋白表达升高不显著，且被培养基中Neogenin部分中和，TEV-1细胞未受到足够Netrin-1蛋白的刺激，导致细胞凋亡率增加。TEV-1细胞增殖情况无明显改变可能与滋养细胞分泌其它细胞因子有关，具体机制仍有待于进一步研究。

综上所述，可溶性Netrin-1受体能促进TEV-1细胞凋亡及Netrin-1 mRNA表达，Netrin-1/Neogenin通路参与了TEV-1细胞凋亡调节过程。

[1]Maillard-Lefebvre H,Boulanger E,Daroux M,et al.Soluble receptor for advanced glycation end products:a new biomarker in diagnosis and prognosis of chronic inflammatory diseases[J]. Rheumatology(Oxford),2009,48(10):1190-1196.

[2]Teoh D G,Secord A A.Antiangiogenic therapies in epithelial ovarian cancer[J].Cancer Control,2011,18(1):31-43.

[3]Cole S J,Bradford D,Cooper H M.Neogenin:A multi-functional receptor regulating diverse developmental processes[J].Int J Biochem Cell Biol,2007,39(9):1569-1575.

[4]Mancino M,Esposito C,Watanabe K,et al.Neuronal guidance protein Netrin-1 induces differentiation in human embryonal carcinoma cells[J].Cancer Res,2009,69(5):1717-1721.

[5]Wilson N H,Key B.Neogenin:one receptor,many functions[J]. Int J Biochem Cell Biol,2007,39(5):874-878.

[6]杨昀,邹丽,徐可树.轴突导向因子netrin-1在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其与胎盘新生血管形成的关系[J].中华妇产科杂志, 2006,41(9):597-600.

[7]Feng H C,Choy M Y,Deng W,et al.Establishment and characterization of a human first-trimester extravillous trophoblast cell line(TEV-1)[J].J Soc Gynecol Investig,2005,12(4):e21-32.

[8]李海玲,彭书明,李凛,等.4种常用蛋白浓度测定方法的比较[J].中国生化药物杂志,2008,29(4):277-282.

[9]Hong M,Schachter K A,Jiang G,et al.Neogenin regulates Sonic Hedgehog pathway activity during digit patterning[J].Dev Dyn, 2012,241(3):627-637.

[10]Fitzgerald D P,Bradford D,Cooper H M.Neogenin is expressed on neurogenic and gliogenic progenitors in the embryonic and adult central nervous system[J].Gene Expr Patterns,2007,7(7):784-792.

[11]De Vries M,Cooper H M.Emerging roles for neogenin and its ligands in CNS development[J].J Neurochem,2008,106(4): 1483-1492.

[12]Srinivasan K,Strickland P,Valdes A,et al.Netrin-1/neogenin interaction stabilizes multipotent progenitor cap cells during mammary gland morphogenesis[J].Dev Cell,2003,4(3):371-382.

[13]Wang W,Reeves W B,Ramesh G.Netrin-1 increases proliferation and migration of renal proximal tubular epithelial cells via the UNC5B receptor[J].Am J PhysiolRenalPhysiol,2009,296(4): F723-729.

[14]Park K W,Crouse D,Lee M,et al.The axonal attractant Netrin-1 is an angiogenic factor[J].Proc NatlAcad SciUSA,2004,101(46): 16210-16215.

[15]谢涵,邹丽,朱剑文,等.轴突导向因子netrin-1基因沉默对胎盘血管生成影响的体内外实验研究[J].中华妇产科杂志,2011,46(5): 364-369.

Effect of soluble Netrin-1 receptor on proliferation and apoptosis of TEV-1 cells

ZHONG Shaoping,SHEN Huaxiang,LIU Xia,et al.

Department of Obstetrics，Jiaxing Women and Children Hospital,Jiaxing 314000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of soluble Netrin-1 receptor on proliferation and apoptosis of human trophoblast TEV-1 cells. Methods Cultured TEV-1 cells were treated with different concentrations of Neogenin (0,1,5,10 and 50ng/ml).After 24h of treatment cell viability was measured by MTT assay;cell apoptosis were assessed by flow cytometry(FCM) assay;the expression of Netrin-1 in TEV-1 cells was observed by indirect cellular immunofluorescence;the mRNA and protein of Netrin-1 were detected by real-time PCR and Western blot,respectively. Results The results of MTT and FCM showed that proliferation of TEV-1 cells was independent of Neogenin.Meanwhile,cell apoptosis increased with the increasing concentrations of Neogenin;the apoptosis rate was 18.70%at 0 ng/ml Neogenin and significantly increased to 56.65%at 50ng/ml Neogenin(P＜0.01).Immunoreactivity of Netrin-1 in cytoplasm of TEV-1 cells was increased along with the increasing concentration of Neogenin.Real-time PCR showed the level of Netrin-1 mRNA,increased by 40.38 times compared to control group when TEV-1 cell was exposed to 50ng/ml Neogenin（P＜0.05）;and the same tendency was not seen by using Western blot（P＞0.05）. Conclusion The soluble Netrin-1 receptor Neogenin enhances Netrin-1 mRNA expression and promotes cell apoptosis in TEV-1 cells,which indicates that Netrin-1/Neogenin pathway may play a role during regulating cell apoptosis of trophoblasts.

Soluble receptor TrophoblastProliferation Apoptosis

2012-03-14）

（本文编辑：严玮雯）

嘉兴市科技局基金资助项目（2011AY1052-2）；嘉兴市政府重点科技创新团队基金资助项目（2011）

314000 嘉兴市妇幼保健院产科

钟少平，E-mail：zhong_hua86@yahoo.com.cn