血必净注射液对兔肢体缺血再灌注损伤的治疗作用研究

张 良，代 维，高志明，周继红，刘大维

缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤是创伤后常见的严重继发性组织损伤之一，在肢体的创伤、断肢再植、血栓形成、组织移植以及止血带的应用时间过长均等经常可遇见。它不仅影响缺血组织器官的存活及功能，而且可累及全身多器官，严重时可引发多器官功能衰竭而导致患者死亡。血必净是一种临床上用于由感染(脓毒症)、严重创伤和烧伤等引起的多器官功能障碍综合征的器官功能受损期及衰竭早期患者的中药注射制剂，有临床文献证实血必净能有效控制炎症递质、改善凝血功能等［1－3］。我们分析推测血必净可能对缺血再灌注组织损伤有一定的防治作用，然而目前尚未见相关文献报导。为此，本研究采用兔下肢缺血再灌注损伤模型，以观察血必净注射液对缺血再灌注组织损伤的防治作用和机制。

材料与方法

1 动物模型及分组

新西兰大耳兔20只，体重2.10～2.30kg，雌雄不拘，随机分为对照组和实验组，每组10只。术前12h禁食，200g/L乌拉坦5ml/kg耳缘静脉注射麻醉。腹股沟及双下肢剪毛、碘伏消毒，于左股三角处暴露左股静脉，置入22#静脉留置针，肝素封管，用于采集血样本。

参照Crinnion等［4］方法建立肢体缺血再灌注损伤动物模型:于右股三角处暴露右股动、静脉，分离股神经，用微血管夹夹闭股动、静脉。然后用缝线沿腹股沟环扎肢体，阻断侧支循环，造成肢体完全缺血。6h后松开缝线及血管夹，恢复股动、静脉血流。实验组于恢复血流后按每公斤体重抽取4ml血必净注射液(天津红日药业股份有限公司，国药准字Z2004003)，用生理盐水配至10ml，缓慢静脉推注;对照组在恢复血流后给予10ml生理盐水，缓慢静脉推注。

2 样本采集及观察指标

于麻醉后30min及松开血管夹后1、2、4、6h 5个时相点采取静脉血样本6ml。分别测定凝血功能:活化部分凝血酶时间(APTT)、纤维蛋白原检测(FIB)、国际标准比率(PT-INR)、凝血酶原时间(PT);血浆生化:白蛋白(ALB)、血清乳酸脱氢酶(LDH)、血清肌酸激酶(CK);自由基相关指标:丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。6h后放血活杀，取右侧股直肌标本，进行组织病理切片苏木精-伊红染色(HE染色)观察，并分别做组织匀浆测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量、干湿比。其中凝血功能、生化项目由大坪医院检验科专人单盲检测完成;MDA、SOD、TNF-α、IL-6含量采用碧云天公司试剂盒在美国Gene公司自动酶标仪上测定。

3 统计学分析

结 果

1 凝血功能变化(表1)

对照组再灌注后静脉血APTT逐渐增加，2h和4h时明显高于再灌注前(P＜0.01)，4h时达到再灌注前的149.54%，6h时恢复至再灌注前水平。实验组再灌后APTT低于对照组，最高值出现在2h，为再灌注前的128.36%，明显高于再灌注前(P＜0.05);4h时即恢复至再灌注前的水平，在1h和4h时非常显著低于对照组(P＜0.01)。

对照组FIB在缺血再灌注前后变化无统计学意义(P＞0.05)，实验组再灌注后4、6h FIB含量均显著高于再灌注前(P＜0.05)。实验组与对照组相比，各时相点差异均无统计学意义(P＞0.05)。

再灌注后2h两组PT_INR最高，对照组再灌注后与再灌注前差异无统计学意义(P＞0.05);实验组再灌注后2h PT_INR(0.93±0.05)非常显著高于再灌注前(0.87±0.03，P＜0.01)，实验组与对照组各时相点差异无统计学意义(P＞0.05)。

再灌注后2h各组PT最高，对照组再灌注后与再灌注前差异无统计学意义(P＞0.05);实验组再灌注后2h、4h PT显著高于再灌注前(P＜0.05)，实验组与对照组各时相点差异无统计学意义(P＞0.05)。

2 静脉血生化项目检测(表2)

两组动物在缺血再灌注后，ALB呈逐渐下降趋势，均在再灌注后4h达到最低值，且显著低于再灌注前(P＜0.05)。对照组再灌注后1～6h均显著低于再灌注前(P＜0.05);实验组再灌注后1h与再灌注前差异不显著(P＞0.05)，2～6h显著低于再灌注前(P＜0.05)。实验组与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。

两组动物再灌注后AST含量较再灌注前有所升高，除对照组再灌注6h与再灌注前无差异(P＞0.05)，其他各时相点均显著高于再灌注前(P＜0.05);两组AST峰值均出现在再灌注后2h，随后有所下降。实验组再灌注后6h AST显著高于对照组(P＜0.05)。

两组动物再灌注后LDH含量较再灌注前有非常显著的升高(P＜0.01)，并在再灌注后2h达到高峰，随后有所下降;2h时对照组LDH含量［(434.86±26.62)U/L］非常显著高于实验组［(331.51±43.67)U/L，P＜0.01］;实验组再灌注后1、2、4h LDH含量均非常显著低于对照组(P＜0.01)。

两组再灌注后CK含量均非常显著高于再灌注前(P＜0.01)，并在再灌注后2h达到高峰，再灌注后4h有所下降。实验组再灌注后1、4h的CK含量均显著低于对照组(P＜0.05)。

3 静脉血MDA和SOD变化(表3)

两组MDA含量在再灌注后1h最高，且显著高于再灌注前(P＜0.05)，随后MDA含量逐渐下降，仅对照组2h非常显著高于再灌注前(P＜0.01)。实验组再灌注后2h MDA含量显著低于对照组(P＜0.05)。

两组再灌注后SOD活性均高于再灌注前，差异非常显著(P＜0.01)。对照组再灌注后4h活性最高(63.32±4.87)NM/ml;实验组再灌注后2h活性最高(66.93±4.96)NM/ml，实验组再灌注后1～4h活性显著高于对照组(P＜0.05)。

4 股直肌TNF-α、IL-6及干湿比比较(表4)

对照组与实验组股直肌内TNF-α、IL-6、干湿比等3个指标差异均无统计学意义(P＞0.05)。

5 组织病理观察

在再灌注6h后，对照组缺血再灌注侧股直肌的肌纤维紊乱，有断裂和坏死区域，可见少量白细胞浸润(图1);实验组可见肌纤维条理清晰，未见明显坏死肌纤维，可见少量白细胞浸润(图2)。

表1 两组的凝血功能指标变化(±s)

表1 两组的凝血功能指标变化(±s)

与对照组比较:＊＊P＜0.01;与缺血再灌注前比较:#P＜0.05，##P＜0.01

项目 组别 再灌注前 再灌注后1h 再灌注后2h 再灌注后4h 再灌注后6h APTT(s) 对照组 26.95±3.76 30.41±3.80 36.90±9.10## 40.30±12.78##25.37±5.90实验组 25.46±4.59 24.82±2.38＊＊32.68±6.84# 25.20±4.79＊＊ 22.56±2.97 FIB(g/L) 对照组 3.83±0.54 3.89±0.65 3.69±0.42 3.89±0.70 3.89±0.57实验组 3.40±0.48 3.41±0.38 3.42±0.45 3.85±0.59# 4.02±0.57#PT_INR 对照组 0.89±0.05 0.88±0.04 0.91±0.04 0.88±0.03 0.87±0.03实验组 0.87±0.03 0.86±0.02 0.93±0.05## 0.89±0.03 0.86±0.04 PT(s) 对照组 10.82±0.73 10.55±0.59 11.02±0.58 10.70±0.50 10.48±0.43实验组 10.43±0.34 10.42±0.36 11.44±0.74## 10.86±0.40#10.34±0.61

表2 两组的静脉血生化项目比较(±s)

表2 两组的静脉血生化项目比较(±s)

与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与缺血再灌注前比较:#P＜0.05;##P＜0.01

项目 组别 再灌注前 再灌注后1h 再灌注后2h 再灌注后4h 再灌注后6h ALB(g/L)对照组 14.38±1.22 12.87±1.15# 12.09±1.47## 11.95±1.27## 10.57±1.49##实验组 15.36±2.17 13.64±1.90 13.00±1.70# 12.81±1.45## 11.23±1.40##LDH(U/L)对照组 119.27±12.78 398.51±27.12## 434.86±26.62## 367.29±29.73## 312.86±44.84##实验组 116.50±11.63 306.46±45.16＊＊## 331.51±43.67＊＊## 314.88±48.44＊＊## 295.08±31.07##CK(U/L)对照组1658.34±110.46 3621.59±314.27## 3755.51±493.39## 3337.91±326.98## 2961.26±213.72##实验组1674.75±130.56 3324.00±217.28*## 3429.92±274.80## 3041.92±253.77*## 2909.95±276.11##AST(U/L)对照组 45.34±9.37 64.42±19.61# 76.96±14.37## 63.25±12.43## 50.56±9.48实验组 41.15±9.68 61.81±7.70## 71.97±13.67## 63.78±7.11## 61.08±7.96*##

表3 两组的静脉血MDA和SOD变化(±s)

表3 两组的静脉血MDA和SOD变化(±s)

与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与缺血再灌注前比较:#P＜0.05，##P＜0.01

项目 组别 再灌注前 再灌注后1h 再灌注后2h 再灌注后4h 再灌注后6h MDA(μM)对照组 31.16±0.71 34.15±2.26## 33.84±2.61##32.05±2.41 31.35±1.25实验组 31.19±1.02 32.77±1.91# 31.65±1.57* 30.80±1.26 30.27±1.08 SOD(NM/ml)对照组 38.32±2.62 49.85±3.70## 53.21±5.61## 63.32±4.87## 48.90±2.86##实验组 38.09±2.34 58.61±5.74＊＊## 66.93±4.96＊＊## 57.21±5.83*## 52.90±5.74##

表4 股直肌TNF-α和IL-6含量及干湿比比较(±s)

表4 股直肌TNF-α和IL-6含量及干湿比比较(±s)

TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)干湿比对照组8.40±0.74 13.90±3.9 0.26±0.02实验组8.40±1.68 12.54±3.0 0.27±0.02

图1 对照组股直肌病理切片(HE×20)

图2 实验组股直肌病理切片(HE×20)

讨 论

肢体缺血再灌注损伤是创伤后常见的严重继发性组织损伤，可导致组织水肿、筋膜间隔综合征、肌纤维挛缩等，严重影响肢体功能恢复，甚至造成肢体的残疾，同时也可造成全身各重要器官及系统不同程度的损伤，对伤员的生命和愈后有着重大的影响。因此，深入研究其发病机制，寻找方便、高效的救治措施有着重要的意义。我国传统中医药中的活血化瘀、改善循环、消炎抗毒等相关方剂在减轻组织损伤等方面起到明显的作用，能够有效缓解肢体IR损伤，提示中医药在创伤救治方面有着巨大的潜在价值。

血必净是由中药红花、赤芍、川芎、丹参、当归等是提取的中药制剂，临床上常用于由感染(脓毒症)、严重创伤和烧伤等引起的多器官功能障碍综合征的器官功能受损期及衰竭早期患者，临床治疗效果良好。已有临床文献证实血必净能有效控制炎症介质、改善凝血功能等［1－3］;以及抑制心肌细胞钙超载，减轻心肌损伤等作用［5－6］。同时，有研究表明血必净的主要成份川芎、丹参等具有清除氧自由基的功能［7］。因此，我们推测中药制剂对缺血再灌注损伤可能有效好的治疗价值。

本实验结果显示，血必净注射液对动物肢体缺血再灌注后的凝血功能有一定的调节作用。具体表现在:实验组再灌注损伤后1h和4h的APTT延长情况较对照组有明显改善(P＜0.01);PT较灌注前有明显的延长(P＜0.05)。另外，再灌注损伤可造成红细胞膜膜磷脂分子过氧化损伤，引起红细胞膜流动性乃至整个细胞变形性明显恶化，严重时嵌顿于毛细血管导致微循环障碍，使组织缺血缺氧。而FIB能吸附于红细胞表面，遮蔽其表面电荷而降低红细胞间的静电斥力，使红细胞聚集性增加［8］。实验组再灌注后4、6h FIB含量较再灌前有显著增高(P＜0.05)，提示血必净注射液可能有助于缺血再灌注后对凝血功能的维护和改善，有助于改善微循环的障碍。

肢体缺血再灌注后，由于缺血再灌注组织细胞中会产生大量氧自由基，并释放出大量炎性递质如白细胞三烯B4和血栓素A2、缓激肽、NO、内皮素等血管活性物质，这些均能使毛细血管内皮细胞受损、通透性增加。随着毛细血管的通透性增加，使血中小分子蛋白渗漏到组织间隙，导致血中ALB水平降低，组织细胞水肿［9］。因此血中ALB降低的程度也间接反应了缺血再灌注损伤的程度。本实验发现再灌注后，实验组和对照组ALB含量均呈进行性下降(P＜0.01)，但实验组再灌注后1h ALB含量与再灌注前无差异(P＞0.05)。提示血必净注射液可能具有改善毛细血管通透性，减轻组织细胞水肿，延缓ALB渗漏的作用。

正常肌细胞内富含AST、LDH、CK等蛋白酶，细胞受损后，酶即释放入血。通常血清中这些酶含量的高低可反映细胞损伤的程度，可作为反映肌细胞损伤严重程度的指标。本实验中，再灌注后，实验组AST含量1～4h与对照组无差异(P＞0.05)，6h时显著高于对照组(P＜0.05);实验组LDH含量在再灌注后1～4h非常显著低于对照组(P＜0.01);实验组CK含量在再灌注后1、4h显著低于对照组(P＜0.05)。提示血必净注射液可能在肢体缺血再灌注损伤早期对肌肉组织细胞的损伤有一定的保护作用。

氧自由基可使细胞膜迅速去极化，破坏膜功能，还可与细胞膜脂质反应生成脂质过氧化物(LPO)［10］。MDA和SOD是反映脂质过氧化程度的一对指标，MDA为LPO的一种，可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞损伤的程度。SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要作用，此酶能清除超氧化物阴离子，防护细胞免受损伤，SOD的测定能反映组织内自由基水平及脂质过氧化程度。本实验发现，实验组再灌后2h MDA含量显著低于对照组(P＜0.05);实验组再灌注后1～4h SOD活性均显著高于对照组(P＜0.05)。提示应用血必净注射液后可减弱自由基引发的脂质过氧化反应，减轻细胞损伤程度，增强清除自由的基能力。

股直肌再灌注后6h实验组与对照组间TNF-α、IL-6、干湿比等指标差异均不显著(P＞0.05)，可能是再灌注后6h肌体由缺血再灌注损伤状态下恢复程度相近，导致差异不显著。

病理切片显示对照组和实验组再灌注后6h肌组织均出现白细胞浸润，但实验组肌纤维条理清晰，无明显异常，对照组有肌纤维紊乱，出现断裂和坏死区域。提示血必净注射液对肌组织有一定保护作用。

综上所述，本实验证实使用中药制剂血必净注射液治疗可以调节肢体缺血再灌注损伤后机体凝血功能，减轻微循环障碍，降低毛细血管通透性，减轻肌组织细胞再灌注损伤，抑制氧自由基的产生、减少LPO的形成，从而对肢体缺血再灌注损伤起到保护作用。

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