茶多酚制品中多酚含量测定方法比较研究

高玉萍，涂云飞，杨秀芳*，梁慧玲，孔俊豪，龚淑英

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.浙江大学茶学系，浙江杭州 310058）

茶多酚制品中多酚含量测定方法比较研究

高玉萍1,2，涂云飞1，杨秀芳1*，梁慧玲1，孔俊豪1，龚淑英2*

（1.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州 310016；2.浙江大学茶学系，浙江杭州 310058）

对福林酚比色法和酒石酸亚铁比色法测定茶多酚制品中多酚含量的适用性进行了比较研究。结果表明：两种方法在测定茶多酚制品的多酚含量时都有良好的稳定性（RSD＜5.1）；两者的测定原理不同，测得的结果具有一定的差距，纯度越高的茶多酚制品，两种方法测定值之间差距越大；用酒石酸亚铁比色法测得的多酚含量有超出100%的现象，福林酚-标准曲线法测得的多酚含量在30.08%～88.76%之间。茶多酚制品中多酚含量宜采用福林酚比色法测定，即福林酚-标准曲线法和福林酚-换算系数法，且换算系数为88.13μg/mL。

茶多酚制品，多酚含量，测定方法，酒石酸亚铁，福林酚

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，由儿茶素类、黄酮类、黄酮醇类、花青素类、花白素类、酚酸及缩酚酸类等物质组成，具有抗氧化、抗衰老、抗辐射、防癌抗癌及调节免疫等功效[1]，并应用于食品、医药、日用化学品、饲料等领域[2-3]。我国茶资源丰富，利用中低档茶、碎末茶与夏秋茶提取茶多酚的工艺已非常成熟。目前，全国大约有近百家规模不一的茶叶深加工企业，如安徽红星药业、江西绿康、浙江东方、无锡世纪生物、浙江瑞安派诺等。随着茶多酚行业的快速发展，市场亟需一个统一的产品质量国家标准去规范和引领，茶多酚制品产品质量标准和测定方法标准等相应标准体系有待建立。

目前茶叶中茶多酚总量的测定方法主要包括酒石酸亚铁络合多酚显色法[4-8]和福林酚氧化多酚显色法[9-12]。酒石酸亚铁比色法的原理是在一定的pH条件下茶叶中的多酚类物质与亚铁离子形成蓝紫色络合物，是络合反应；福林酚比色法则是利用福林酚试剂氧化茶多酚中的-OH，并显蓝色，是氧化还原反应[13]。在国家标准和国际标准[9-10]体系中，茶叶及速溶茶中多酚含量的测定已采用福林酚比色法。但茶多酚制品中多酚含量的测定，至今只有1995年发布的轻工行业标准中有所涉及，即茶多酚行业内正在广泛应用的酒石酸亚铁比色法。该法是否还适用于当前茶多酚含量的测定，值得探讨。因此，本文拟通过分光光度法进一步比较分析酒石酸亚铁比色法和福林酚比色法在测定茶多酚制品中多酚含量上的适用性，为茶多酚制品中多酚含量检测方法标准的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

不同规格的茶多酚制品购自多个国内茶多酚生产企业；儿茶素组分标准品（EGCG、GCG、ECG、EGC、EC，纯度≥98%）购自成都普瑞法科技开发有限公司；咖啡碱标准品由国家茶叶质量监督检验中心提供；福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂购自上海聚源生物科技有限公司；酒石酸钾钠（纯度≥99.0%）购自上海美兴化工有限公司；七水硫酸亚铁（纯度≥99.0%）购自衢州巨化试剂有限公司；无水碳酸钠（纯度≥98%）购自上海美兴化工有限公司；没食子酸乙酯（纯度≥98%）购自成都西亚化学试剂科技有限公司；一水合没食子酸（纯度≥98.5%）购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）购自天津市康科德科技有限公司；冰醋酸（纯度≥99.5%）购自杭州化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

紫外可见光分光光度计购自尤尼柯上海仪器有限公司；Waters高效液相色谱仪配备Waters 1525双元泵、柱温箱、2487双通道紫外可见检测器、717plus自动进样器、Breeze控制软件，购自Waters科技（上海）有限公司；AL204电子天平购自梅特勒—托利多仪器有限公司；实验室级纯水器购自南京易普达科技发展有限公司。

1.3 多酚含量测定

准确称取0.1g茶多酚样品于烧杯中，加入小于60℃水25mL左右，充分溶解后冷却定容至100mL容量瓶中，即为1mg/mL的母液，待用。酒石酸亚铁比色即用母液，福林酚比色时取2.5mL母液定容至50mL容量瓶中。酒石酸亚铁比色法基于中华人民共和国轻工行业标准（QB 2154-95）[6]，即1mL样品或标准品加入5mL酒石酸亚铁试剂，充分混匀后用pH7.5的磷酸缓冲液定容至25mL，于540nm测定1cm比色皿中的吸光值；福林酚比色法参照ISO标准[9]执行，即1mL样品或标准品加入5mL 10%的福林酚试剂后，于3～8min内加入4mL 7.5%的碳酸钠溶液混匀，反应60min后，于765nm处测定吸光值。

1.4 茶多酚含量计算

1.4.1 福林酚-标准曲线法

用没食子酸（10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL）作标准曲线，按下式计算茶多酚含量：

式中：E为根据试样测得的吸光度，从标准曲线上查得的没食子酸相应含量，μg/mL；V为样品溶液的体积，mL（本实验中为100mL）；d为测得吸光度前的稀释因子（本实验中将2.5mL稀释到50mL，稀释因子即为20）；m为样品质量，g；G为试样水分，%；没食子酸标准曲线：y=0.0109x+ 0.0084，R2=0.9992。

1.4.2 酒石酸亚铁-标准曲线法

用没食子酸乙酯50mg/100mL、100mg/100mL、150mg/100mL、200mg/100mL、250mg/100mL作标准曲线，按下式求出茶多酚含量：

式中：E为根据试样测得的吸光度，从标准曲线上查得的没食子酸乙酯相应含量，mg/100mL；1.5为茶多酚的换算系数；m为样品质量，mg；G为试样水分，%；没食子酸乙酯标准曲线：y= 0.0057x-0.0051，R2=0.9998。

1.4.3 酒石酸亚铁-换算系数法

行业中常采用酒石酸亚铁法结合2.884的换算系数计算茶多酚含量，按照下式计算茶多酚含量：

式中：A为吸光度；V为试样体积，mL（本实验中为100mL）；m为样品质量，mg；G为试样水分，%。

1.5 儿茶素含量测定

儿茶素含量测定采用高效液相色谱法[14]，并以咖啡碱作为内标定量各成分。液相色谱洗脱条件为100%初始相A相（纯水含有9%的乙腈，2%的冰醋酸及20μg/mL的EDTA·2Na）维持10min，然后流动相B（80%乙腈，2%冰醋酸及20μg/mL的EDTA·2Na的水溶液），经15min线性梯度增加至32%，维持10min，再1min回至初始流动相A，平衡10min，准备下一针样品分析。流速为1mL/min，色谱柱为Hypersil ODS-C18（250mm× 4.6mm i.d.），柱温35℃±0.5℃。

1.6 统计方法

实验数据采用办公软件Office Excel 2003进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同测定方法的稳定性比较

随机选取高、中、低三种纯度的茶多酚样品（A、B、C）进行测定方法的稳定性比较。采用三种不同的处理方式，对两种不同的测定方法（福林酚-标准曲线法和酒石酸亚铁-标准曲线法）进行相对标准偏差分析。由表1可知，无论是福林酚比色法还是酒石酸亚铁比色法，其RSD都在合理的范围内（RSD＜5.1%）。这说明，从稳定性的角度来看，两种方法都是可行的。

表1 两种方法的稳定性评价（n=6）Table 1 Comparison of stability of two methods(n=6)

2.2 不同测定方法所得结果的数值比较

表2为不同方法测得的茶多酚制品中儿茶素及茶多酚总量结果，由数据分析可以看出，若以福林酚法的数据为依据，儿茶素约占茶多酚总量的73%，说明儿茶素总量在多酚中的分布与茶叶相似。不同方法测得多酚含量数据高低依次为：酒石酸亚铁-换算系数法＞酒石酸亚铁-标准曲线法＞福林酚-标准曲线法。在茶多酚纯度较低的情况下，三种方法的差距较小，随着茶多酚纯度的增加，三种方法所得结果之间的差距越来越大。酒石酸亚铁-标准曲线法与福林酚-标准曲线法之间的差距为0.14%～23.95%，酒石酸亚铁-换算系数法与福林酚-标准曲线法之间的差距为2.36%～34.99%，酒石酸亚铁-换算系数法与酒石酸亚铁-标准曲线法之间的差距为1.87%～11.04%。同时，由这些数据可以获得三种方法所得结果的换算公式：

其中：X为根据福林酚-标准曲线法计算得到的茶多酚含量数值；

Y1为根据酒石酸亚铁-标准曲线法计算得到的茶多酚含量数值；

Y2为根据酒石酸亚铁-换算系数法计算得到的茶多酚含量数值。

分析还发现，利用酒石酸亚铁-标准曲线法测得的结果中，共4个样品的数据超过100%，酒石酸亚铁-换算系数法的数据更高，共9个样品超出100%。而福林酚方法得到的结果均在100%以内。这表明，在利用酒石酸亚铁比色法测定茶多酚制品中的多酚含量时，行业中广泛使用的换算系数过高，而利用标准曲线也不能够获得关于茶多酚纯度的准确可信的数据结果。因此判断，现有的两种利用酒石酸亚铁比色法测定多酚含量的方式都不能适用于茶多酚制品中多酚含量的测定。利用福林酚方法测得的结果中，多酚含量的范围为30.08%～88.76%。

表2 不同方法测得的茶多酚含量及样品儿茶素总量Table 2 Total polyphenols'content measured by different methods and total catechins content of samples

2.3 福林酚—换算系数法研究

现有的福林酚比色法是利用没食子酸标准曲线来定量多酚含量的，若可以在大量实验的基础上根据不同时间、不同样品、不同标准曲线的测量获得一个换算系数，便可节约大量的时间与成本。

本实验根据37个样品的福林酚方法测得的茶多酚含量，计算获得福林酚方法的换算系数：

式中：ω为根据福林酚方法结合没食子酸标准曲线测得的茶多酚含量，%；m为样品质量，g；G为试样水分，%；A为吸光度；V为样品提取液的体积，mL（本实验中为100mL）；d为测得吸光度前的稀释因子（本实验中将2.5mL稀释到50mL，稀释因子即为20）。

取37个样品的平均值，得到福林酚比色法的换算系数为88.13μg/mL，即单位吸光度对应的多酚浓度为88.13μg/mL。利用该换算系数得到的多酚含量计算公式为：

式中字母的含义与上式相同。

由该公式换算得到的样品茶多酚含量的范围为30.51%～89.36%，与福林酚—标准曲线法获得的结果基本吻合。

3 结论

现阶段茶多酚制品中多酚含量的测定，仍然采用我国轻工业行业标准QB 2154-1995《食品添加剂茶多酚》，即用酒石酸亚铁比色法，结合标准曲线进行结果的计算或业内以该标准为基础，用经验系数2.884进行换算。但是从本实验的结果看来，利用酒石酸亚铁-换算系数法与酒石酸亚铁-标准曲线法，所获得的茶多酚含量均有高于100%的现象，说明利用这两种方式对茶多酚制品中茶多酚的含量进行测定时，测定结果偏高，不能准确反映茶多酚的实际含量。

福林酚法已作为国际标准方法应用于茶叶和速溶茶制品中多酚含量的测定，国家标准GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》等同采用ISO 14502-1:2005《福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂比色法测定茶叶中茶多酚总量》，以福林酚方法取代酒石酸亚铁比色法测定茶叶中的茶多酚含量。本文利用福林酚—标准曲线法开展了茶多酚制品中茶多酚含量的测定，发现测定方法简单、重复性好，37个纯度各异的茶多酚制品的测定结果处于30.08%～88.76%范围之间。同时通过分析茶多酚测定结果数据，获得了更简单的测定方法，即福林酚—换算系数法，其中换算系数为88.13μg/mL，利用该换算系数得到的茶多酚含量范围为30.51%～89.36%。

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Methods Comparison of Determinating the Polyphenols Content in Tea Polyphenols Products

GAO Yu-ping1,2,TU Yun-fei1,YANG Xiu-fang1*,LIANG Hui-ling1,KONG Jun-hao1,GONG Shu-ying2*
(1.Hangzhou Tea Research Institute,CHINA COOP,Hangzhou 310016,China; 2.Department of Tea Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Tea polyphenol product is a kind of complex product extracted from tea.Applicability of ferrous tartrate method and Folin-Ciocalteu method in determining total polyphenols'content of tea polyphenol products were discussed in this paper.The results showed that both of them were stable with RSD＜5.1.Two methods had different results,because the measuring principles of them were different.As the purity of tea polyphenol products improving,differences between two methods'results were bigger.Status of Folin-Ciocalteu-standard curve method ranged from 30.08%to 88.76%while several data of ferrous tartrate method exceeded 100%.It was summarized that Folin-Ciocalteu methods including Folin-Ciocalteu-standard curve method and Folin-Ciocalteu-conversion ratio method were better than ferrous tartrate method in determining total polyphenols'content of tea polyphenol products and it was calculated that the conversion coefficient was 88.13μg/mL.

Tea polyphenols products,Total polyphenols'content,Methodologies,Ferrous tartrate, Folin-Ciocalteu

TS272.5；Q946.8

A

2095-0306（2013）03-0028-05

2013-06-17

国家质检公益项目（201110210）

高玉萍（1988-），女，山东泰安人，硕士，主要从事茶叶品质化学、茶资源综合利用及茶叶加工与审评的研究。

*通讯作者：teatesting@sina.com,shuygong@zju.edu.cn

中国茶叶加工2013，（3）:28～32