脐橙精油氧化还原性对油胞下陷病害的影响

汪源　刘永忠　彭抒昂　胡先文

摘 要： 【目的】为了探索脐橙果皮精油氧化还原性与柑橘果实油胞下陷病害的关系，【方法】以奉节脐橙为试材，对奉节脐橙正常和油胞下陷病发生较严重的果实在病变过程中果皮精油的pH、维生素C含量、活性氧产生速率及抗氧化活性的变化情况进行了分析。【结果】结果表明，在整个贮藏过程中，奉节脐橙果皮油胞下陷病发生率和果皮精油pH随贮藏时间的增加而上升，外皮组织中溢出的精油的氧化性使病变率显著增加；正常果的果皮精油产生活性氧速率低于症状果，但抗氧化活性和维生素C含量高于症状果。【结论】说明奉节脐橙精油氧化还原性是果皮油胞下陷病害的影响因素。

关键词： 脐橙； 油胞下陷； 精油； 活性氧； 抗氧化活性

中图分类号：S666.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0094-05

重庆市奉节县是我国柑橘的优势产区，但当地独特的土壤气候条件也使柑橘易发生油胞下陷病，严重影响了柑橘果实的外观，大幅度降低了果实的商品性能。柑橘油胞下陷病（又叫油斑病、油胞病、油胞凹陷，英文名为Oil Spotting，Oleocellosis）是柑橘产区普遍发生的生理性病害[1-2]，在果实成熟期和采后贮藏期间发病较为严重，使果皮表面形成不规则的浅绿色或黄色、褐色病斑。病斑内油胞明显突出破裂，油胞间组织凹陷，进而出现萎缩形成病状。由于油胞枯萎主要发生在柑橘的黄皮层，所以油胞下陷病一般不会引起果实腐烂，但病斑易受青霉、绿霉菌侵染而导致果实变味腐烂，严重影响果实的外观和商品性，导致其在市场上的售价远远低于没有患油胞下陷的果实，给我国柑橘种植户造成巨大的经济损失，严重制约了我国柑橘产业的发展。

柑橘油胞下陷长期不太受人关注，国内外近年来的相关研究报道很少。有研究发现，柑橘油胞下陷病的发生与外部环境条件有着密切的关系[3-6]。如由于气候变化如降雨、干旱或灌溉等原因，柑橘园土壤质地、土壤肥力、植株营养水平和植株呼吸速率降低时，果实水份代谢失调，易导致该病的发生。Shomer等[7]研究发现，渗到橘皮下表层组织的橘油阻碍了叶绿素向成色素细胞的分化而发生病变。在病斑的形成与褐变过程中，细胞壁的破裂变形及氧化酶如PPO（多酚氧化酶）、CAT（过氧化氢酶）等也起到了重要的作用[8]。Sawamura等[9]研究发现，柑橘外皮组织中的油胞破裂后渗出的具有光毒性的橘油对果皮造成了伤害。油胞的橘油释放压和流出橘油毒性的大小与内源激素GA3[10]和乙烯[11]等也有关。另外，较强的阳光直射和果面高温容易引起外果皮组织受损[12]，以及机械损伤在果皮上造成伤口，油胞中渗出的橘皮精油会使病斑进一步扩大。以前的研究多是关注如何通过控制采前条件来控制果实的病害，而事实上，即使采用健康的果实贮藏，在贮藏期依然会发生比较严重的油胞下陷病。目前，对柑橘果皮精油抗菌性研究较多，但对于果皮精油引起柑橘油胞下陷病及其氧化还原性与油胞下陷病的关系的研究少见报道。我们以‘奉节脐橙为试验材料，用外源精油处理脐橙，研究经处理后脐橙油胞下陷的发生状况及在贮藏过程中果皮精油活性氧的产生速率及病变过程中抗氧化指标的变化情况，以探索外源精油氧化还原性对脐橙果皮油胞下陷病的影响，为有效防治油胞下陷提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

‘奉节脐橙（Citrus sinensis Osbeck）果实采于奉节县一商业园，挑选新鲜无机械损伤，大小均一，成熟度一致的果实进行分装处理，于适宜温度和湿度条件下贮藏。

1.2 方法

1.2.1 脐橙果皮精油的制备 根据Sawamura等[13]介绍的方法，稍做修改，具体方法为：将新鲜的正常脐橙果皮削去白皮层，放入5%左右的石灰水中浸泡8～16 h后，取出、洗净。用双手手指一点一点弯折外果皮使油泡破裂，让精油射出，置于含饱和氯化钠溶液的玻璃离心管管口的漏斗进入离心管中（离心管放于冰浴里），用高速离心机在5 000 r·min-1下离心10 min，用吸管吸出上层液，加入无水硫酸钠脱水，于5 ℃冰箱中放置过夜（注意保存），于5000 r·min-1下再离心10 min ，得冷压精油A，用同样的方法提取发生症状的脐橙果皮精油B。

1.2.2 脐橙果皮精油处理‘奉节脐橙果实 将无症状的、无机械损伤、大小均一、成熟度一致的果实洗果晾干后，进行以下各种处理：（1）将脐橙精油滴加到水果包装纸上，然后将其包装脐橙；（2）直接将脐橙精油涂抹于脐橙果实表面；（3）用2%的维生素C处理后将脐橙精油涂抹于果实表面；（4）不做任何处理。4种方式每处理50个，处理后分别用厚度为0.02 mm的聚乙烯袋单果包装，将其储藏于4℃冰箱中。每周统计果皮油胞下陷病害的发生情况，3次重复。参照Knight等[8]的方法进行标准分级及计算。油胞下陷级别：0为无；1为较轻微；2为轻微；3为中等；4为严重。

油胞下陷指数=∑（塌陷级别×该级别果实占总果实的百分比）

1.2.3 脐橙果皮精油pH的测定 在室温下（16～25 ℃）用pH计对上述制备好的2种脐橙精油分别进行测定，取3次结果的平均值，测定范围为0～14，每周定期测定pH值并观察颜色变化情况。

1.2.4 脐橙果皮精油活性氧产生速率的测定 参照王爱国等[14]的方法并加以改进。取1.0 mL冷压精油加入磷酸缓冲液（pH 7.8）1.0 mL和10 mmol·L-1盐酸羟胺0.1 mL，在25 ℃混合并培养20 min。取0.5 mL培养液依次加入0.5 mL 17 mmol·L-1对氨基苯磺酸和0.5 mL 7 mmol·L-1 α-萘胺，在25 ℃反应20 min，反应后的显色液用同体积正丁醇充分摇匀，离心分层，取正丁醇相在412 nm处测定样品吸光值，用磷酸缓冲液代替样品作空白。样品重复测定3次，每周定期测定1次。活性氧产生速率以μmol·g-1·min-1表示。

1.2.5 脐橙果皮精油维生素C含量的测定

1）标准曲线。用钼蓝比色法测定，制作标准曲线： 取7支25 mL容量瓶，依次加入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、l.20 mL 维生素C标准液（1 g·L-1），然后加草酸-EDTA溶液10.00、9.80、9.60、9.40、9.20、9.00、8.80 mL，最后各管分别加入1.00 mL偏磷酸-醋酸，3.00 mL 6%硫酸，3.00 mL 6%钼酸铵溶液。放置10 min显色稳定后，用1号空白为参比于840 nm波长下测OD。以维生素C含量为横坐标，吸光值为纵坐标做标准曲线，得到曲线方程y=0.014x-0.004。

2）维生素C含量的测定。取精油1.00 mL于25 mL容量瓶中，依次加入9.00 mL草酸-EDTA溶液，1.00 mL偏磷酸-醋酸溶液，3.00 mL 6%硫酸，3.00 mL 6%钼酸铵溶液，显色，以蒸馏水为参比，于840 nm波长下测OD。每周定期测定1次， 每次重复3次。

1.2.6 脐橙果皮精油抗氧化活性的测定 采用DPPH·清除能力来确定抗氧化效果[15]。称取DPPH·试剂0.2561 g，无水乙醇溶解，转入1 000 mL容量瓶中，无水乙醇定容，摇匀得浓度为256.1 mg·L-1 DPPH·储备液（约6.5×104 mol·L-1 [16]），置于冰箱中冷藏备用，使用前用无水乙醇稀释至浓度为25.61 mg·L-1。在最大波长516 nm，按表1加样测定各吸光值（A）。每一吸光度平行测3次，取其平均值，每24 h测定1次，清除率按下式计算：DPPH·自由基清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100。

1.3 数据分析

采用Excel 2007统计分析所有数据，计算标准误差并制图；应用SPSS11.5软件对数据差异显著性进行分析，P<0.05表示差异显著。完成果皮油胞病害发生率与精油氧化还原性的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 脐橙果皮精油处理后对脐橙果皮油胞病害发生率的影响

由图1可知，脐橙果实经果皮精油不同方法处理后，直接涂抹精油的果实发生油胞下陷病害的比例显著大于其他处理的脐橙果实，贮藏的脐橙果皮油胞下陷指数随贮藏时间而缓慢增加。直接涂抹精油的脐橙在后期贮藏时（至56 d）果皮油胞下陷指数增加到接近4.00，高于其他方式处理的贮藏果实（P<0.05），而其他方式处理的则分别为3.61、3.35和3.06。另外，用维生素C处理过后涂抹精油的脐橙与未涂抹精油的脐橙在前14 d发生油胞下陷的指数非常接近（至14 d时分别为1.76和1.68），并无显著差异（P>0.05），但从第21天开始出现差别，此时维生素C慢慢失去抗氧化作用，往后逐渐加重，至第8周时，维生素C处理过的果皮油胞下陷指数增加到3.35，4者之间显著性差异（P<0.05），但相较于处理方式1与2，用维生素C处理过涂抹精油后的脐橙发生油胞下陷的时间及程度均都有所降低，说明维生素C的抗氧化作用处理能降低油胞下陷的发生。

2.2 脐橙果皮精油pH 变化情况

由表2可知，通过对精油pH值的测定，发现随着贮藏时期的延长，pH值在缓慢的逐渐增大，在第49天时，2者的pH值分别达到了6.12和6.34，2者的pH值变化在贮藏期间并无显著差异（P>0.05）。而2种精油的颜色随着贮藏时间的增加也在逐步的加深，至第49天时分别变为棕黄色和棕色，症状果精油的颜色更深，且随着时间的增加，其pH值仍在不断增加。

2.3 脐橙果皮精油活性氧产生速率的变化

由图2可知，症状果和正常果采后贮藏期间活性氧产生速率均有一高峰，之后逐渐呈下降趋势。刚开始几周活性氧产生速率较快，症状果在第28天活性氧产生速率达到了0.93 μmol·g-1·min-1，比正常果升高了4.5%，而正常果产生活性氧速率上升缓慢，至第35天时，活性氧产生速率为0.89 μmol·g-1·min-1。在前28 d，症状果产生活性氧速率明显高于正常果，且呈上升趋势，从第35天开始，活性氧产生速率逐渐下降，并且2者差异不显著（P>0.05）。在整个贮藏期间，2种果皮精油活性氧产生速率无显著性差异（P>0.05）。

2.4 脐橙果皮精油维生素C含量变化

由图3可知，果皮精油中维生素C含量非常低，且随时间增加而逐渐降低，贮藏期间正常脐橙果皮精油维生素C含量显著高于症状果皮精油维生素C 含量（P<0.05），2种果实在贮藏过程中，果皮精油维生素C含量在不断的下降，正常脐橙果皮精油在贮藏前的维生素C含量为23.4 mg·L-1，比症状脐橙果皮精油在贮藏前的维生素C含量高10.38%，脐橙果实在贮藏49 d后，果皮精油维生素C含量急剧下降，分别下降了82.05%，83.96%。随着时间的增加，仍然有继续下降的趋势。

2.5 脐橙果皮精油的抗氧化活性

结果表明，2种脐橙果皮精油对DPPH自由基有一定的清除能力，正常果皮精油清除DPPH能力显著高于症状果（P<0.01），2者的清除率在第7天时分别为74.39%和68.46%，表明其具有一定的抗氧化活性；且正常脐橙果皮精油的抗氧化活性明显高于发生症状的（P<0.05）。实验结果同时发现，橘皮精油的抗氧化活性表现出随着放置时间的增加而逐渐下降，放置21 d后，其对DPPH·的清除率分别下降了8.8%和15.8%，随着精油存放时间的延长，其抗氧化能力还在不断的下降（图4）。

3 讨 论

脐橙果实经果皮精油处理后，油胞下陷发生率明显增加，说明精油可诱导脐橙油胞下陷病害的发生。分析认为果皮精油诱导后，引起了果皮细胞代谢紊乱，造成了果皮组织的膜脂过氧化和脱酯化作用[16-18]，致使病害发生。分析认为，由于脐橙精油暴露在空气中极易被氧化，在精油的氧化过程中对果皮油胞造成了不同程度的伤害，从而诱导了油胞下陷的发生。脐橙果皮精油氧化还原性会导致果实油胞下陷病发生，精油活性氧产生速率及抗氧化活性的变化为这一机理提供了依据。但对于橘油诱导油胞下陷病的机制还需要进一步研究。

脐橙果实采后在贮藏过程中正常果和油胞果的油胞病害发生率与活性氧、维生素C含量等都密切相关。正常果皮精油维生素C含量、抗氧化活性明显高于症状果；果皮油胞下陷病害的程度随着活性氧的增加而逐渐的加重。因机体在正常的生命过程中伴有活性氧自由基的产生，根据活性氧自由基伤害学说，在正常生理条件下，植物体内产生的活性氧不足可使植物受到伤害，如果活性氧的产生加快，而清除系统的功能降低，就会使活性氧在体内积累。随着时间的变化，果实体内氧化代谢发生变化，果实的抗病能力改变，导致病变发生。此外，这可能与氧化性爆发（oxidative burst）有关，即果皮组织或细胞在受到病菌或诱病因子的诱导下能在一定的时间内产生大量的活性氧物质，使细胞中活性氧的水平比正常高2～5倍，这些活性氧具有强氧化性，使果皮受到伤害，从而更易发生病变。

橘皮精油具有一定的抗氧化能力，但随着精油存放时间的延长，其抗氧化能力有下降的趋势。而由果皮提取的脐橙精油经科学鉴定主要含有D-柠檬烯，它在植物抗氧化中起关键作用。然而D-柠檬烯是一种不稳定的有机物，在光照和水分的影响下，它能自动氧化成香芹酮、香芹醇及一系列杂质，从而慢慢失去了抗氧化的作用。本研究结果表明，果皮精油的氧化破坏是导致脐橙发生油胞下陷的重要原因之一。因而，在本实验条件下控制精油的氧化破坏，可以显著降低脐橙果实油胞下陷的发生。

4 结 论

脐橙果皮精油对脐橙果实油胞下陷发生率及发生程度均有显著影响，同时果皮精油具有一定的抗氧化能力，且其抗氧化性活性随放置时间的延长而逐渐降低，精油的氧化还原性对油胞下陷的发生产生影响。同时正常果与症状果精油的维生素C含量、活性氧产生速率呈显著性差异。也证实了果皮精油的抗氧化性影响着油胞下陷的发生。

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