应用2D—DIGE技术分析柑橘衰退病毒诱导的甜橙差异表达蛋白

杨方云　李中安　周常勇　周彦

摘 要：【目的】为了研究柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）诱导甜橙差异表达蛋白的分离和鉴定，【方法】以接种了CTV的甜橙植株为实验组，健康植株为对照组，利用双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术分析CTV诱导的甜橙差异表达蛋白。【结果】以t检验P<0.05和相对表达量≥1.5的水平作为判别标准，获得了91个CTV诱导的差异表达蛋白点，在实验组中含量高于对照组的蛋白56个，含量低于对照组的蛋白35个。通过MALDI-TOF质谱分析成功鉴定从中选择的37个蛋白点，其中19个蛋白功能明确，16个为预测或假定具有某种蛋白功能，包括与抗氧化相关的硫氧还蛋白、铁氧还蛋白、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化酶，与代谢相关的磷酸甘油酸酯水解酶、木葡聚糖内糖基转移酶、变味蛋白，分子伴侣热激蛋白，折叠酶肽酰脯氨酰顺反式异构酶，以及与光合代谢相关的蛋白等。【结论】CTV的侵染影响到甜橙各种复杂的生物学过程。

关键词： 柑橘； 衰退病毒； 蛋白； 双向荧光差异凝胶电泳

中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0016-06

柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）是柑橘生产上具有经济重要性的病毒病，从上世纪30年代起，该病已造成世界上至少1亿株柑橘死亡，在我国柑橘产区也广泛分布[1]。CTV主要通过感病接穗、苗和蚜虫传播，仅用无病毒苗木不能完全控制该病的流行[1]。目前，在基因水平已开展了CTV致病机理的研究，但在蛋白水平的研究还很少，仅有林尤剑等[2]和范旭东等[3]检测了CTV病程相关蛋白。由于蛋白质是生物体功能的执行单元，很多重要的生物学反应，如磷酸化、糖基化修饰等都发生在蛋白水平上，因此从蛋白组学方面深入探讨CTV致病机理具有重要意义。我们以感染柑橘衰退病的甜橙为对象，通过双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）技术分析CTV诱导甜橙差异表达蛋白，可以为CTV致病机制的研究提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料

实验材料为同一母树来源的甜橙实生苗，品种为锦橙（Citrus sinensis L.），其对柑橘衰退病较为敏感。接种用CTV毒源为田间混合株系，均由中国农业科学院柑桔研究所国家柑橘苗木脱毒中心提供。

1.2 实验设计

设实验组为接种CTV后6个月的2 a生甜橙5株，对照组为健康甜橙5株。2组样品分别由每组中5株甜橙叶片按相同质量混合而成，每组称量1 g混合样进行蛋白提取，重复3次。

1.3 蛋白提取

取甜橙叶片样本，液氮中用研钵磨碎成细粉状，采用TCA/丙酮法去除杂质，空气干燥样品，加入0.5 mL细胞裂解液（7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫尿， 4% CHAPS， 0.2% IPGbuffer），超声破碎细胞，12 000×g转速离心45 min，取上清用0.22 μm膜过滤获得澄清溶液，采用Bradford法[4]定量后按每管100 μg分装样品，-80 ℃保存备用。

1.4 2D-DIGE电泳分析

取用每组蛋白样品50 μg，分别标记400 pmol的染料分子Cy3和Cy5。分别取实验组和对照组蛋白样品各25 μg进行混合，标记400 pmol的染料分子Cy2，作为内标。每块凝胶同时上样3种标记样品，3次重复。选择pH值3～10 NL胶条，在IPGphor 3等电聚焦仪（GE）中进行等电聚焦，胶条平衡后，采用 12.5%的SDS-PAGE凝胶对蛋白质进行第2向分离。电泳完成后采用Typhoon 扫描仪（GE）对3种荧光分别采集图像信息，利用 DeCyder 2DTM软件（GE）对图像进行处理和分析。

1.5 差异蛋白的质谱鉴定与分析

从制备胶中选择差异蛋白点，进行凝胶的胶内酶解（Trypsin，20 h），抽提酶解肽段后通过ZipTip脱盐处理，采用4800型飞行时间质谱仪（ABI）完成MALDI-TOF质谱鉴定。

1.6 蛋白质肽指纹图谱（PMF）的检索

采用标准的检索方法，在MASCOT（http：//www.matrixscience.com/）进行检索，采用NCBI数据库，设置参数：Missed Cleavages为1，Mass Tolerance为 ± 0.8 Da，Fixed modifications为Carbamidomethyl （C）。

2 结果与分析

2.1 CTV甜橙叶中差异蛋白2D-DIGE图谱分析

实验组和对照组经荧光染料标记后共6例样品进行双向电泳分离，在3张凝胶上获得9幅不同荧光DIGE图谱，图版-A～E为其中一张凝胶上获取的3幅胶图和叠加图谱。从图上可看出，各蛋白质点分离清晰，无明显杂质干扰和拖尾现象。应用DeCyder 2DTM软件对获得的9幅凝胶图谱进行胶内差异分析和凝胶间比较分析，以t-test 检验P<0.05 并且相对表达量差异在1.5倍水平以上（Relative Average Ratio≥1.5）作为判别差异蛋白的标准，共发现91个差异蛋白点，其中实验组较对照组上调的蛋白有56个，下调的蛋白有35个（表1）。

2.2 MALDI-TOF MS质谱分析

从发现的91个差异蛋白点中选择分离明显的37个蛋白点进行MALDI-TOF MS质谱鉴定，图1显示37个蛋白点在凝胶上的分布情况。分析结果发现，37个差异蛋白的PMF图谱信号均较为明显，信噪比较高。利用Data explore软件对这些蛋白的PMF图谱进行处理，以及NCBI数据库搜索，37个蛋白均得到成功鉴定，可信度C.I.%得分超过95%。以蛋白点1为例，检测到信号强度超过30%的肽段峰23个（图2），数据检索结果显示蛋白得分为77，C.I.%得分99.77%，通过软件预测的等电点和分子量与图谱中的显示均相近。表2中列出了匹配峰值的氨基酸序列信息。

2.3 CTV甜橙叶中相关差异蛋白的鉴定

在选择鉴定的37个蛋白点中，均有相关基因序列的报道，其中19个蛋白功能明确，16个为预测或假定具有某种蛋白功能，2个假定蛋白功能尚不完全清楚（表3）。这些蛋白涉及到许多生物学反应，如与光合代谢有关的核酮糖磷酸羧化酶/加氧酶大小亚基、捕光叶绿素a/b结合蛋白前体、放氧蛋白，与抗氧化相关的硫氧还蛋白、铁氧还蛋白、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化酶，与代谢相关的磷酸甘油酸酯水解酶、木葡聚糖内糖基转移酶、变味蛋白，以及分子伴侣热激蛋白、折叠酶肽酰脯氨酰顺反式异构酶等，这有利于对CTV与寄主互作机制的认识。

3 讨 论

研究通过检索蛋白质数据库生物学信息，鉴定出11个差异表达蛋白与甜橙上CTV诱导密切相关。其中，硫氧还蛋白、抗坏血酸过氧化酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）属于抗氧化活性酶类，在植物抗病调控清除活性氧自由基中起到积极作用。在Sweat等[5]和Hong等[6]的研究中发现硫氧还蛋白对植物病害具有抑制作用，病害胁迫还显著诱导寄主植物大量表达抗坏血酸过氧化酶[7-8]和超氧化物歧化酶[9-10]。本研究中这3种蛋白表达在感染CTV的甜橙上均显著上调，表明感病甜橙启动了抗病调控活动，通过表达抗氧化蛋白以增强自身抗病性。

铁氧还蛋白-NADP+还原酶（FNR）是一种影响植物各种营养代谢活动的重要酶类，它催化还原型铁氧还蛋白和NADP+ 生成氧化型铁氧还蛋白和 NADPH，产物NADPH参与了植物的多种营养代谢，感病植物中FNR表达显著上调[11-12]。本研究也得出相同结果，说明寄主植物受到病原的侵染后会主动上调表达FNR，增强营养代谢活动以对抗病原的伤害。

木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶（XTHs）介导初生细胞壁中β（1-4）-木葡聚糖的裂解和聚合，在木葡聚糖交联的形成和重构中发挥重要作用。它作为一种细胞壁修饰蛋白，在植物生长和发育过程中参与细胞壁的修饰过程。Cristafni-Yaly等[13]和Albrecht等[14]通过转录组与EST序列分析结果与本研究均发现感病植物上木葡聚糖内糖基转移酶表达显著上调，说明病原侵染可诱导寄主木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶活性，对病原入侵产生抵抗作用。

甘油酸酯水解酶，又称烯醇化酶（enolase），存在于植物所有组织器官中，在糖酵解作用中将2-磷酸甘油酸催化生成一种称为磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸分子，它对植物生长发育的能量代谢非常重要。当植物受到病原侵染后，甘油酸酯水解酶的表达会因不同寄主出现明显下调[15-16]或上调[17]。本研究均发现CTV诱导甜橙甘油酸酯水解酶表达显著上调，与Cristofani-Yaly等[13]研究结果一致。

异柠檬酸脱氢酶（IDH）是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，它催化第三步异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸，反应脱下的氢由NAD（P）+接受生成NAD（P）H，影响着植物体糖、脂肪和蛋白质的代谢。最近研究发现病原侵染植物将引起异柠檬酸脱氢酶表达显著下调，异柠檬酸脱氢酶还是病原寄主互作中的氧化还原信使[18]。本研究病株上异柠檬酸脱氢酶表达显著下调，可能对病株的营养代谢产生抑制和充当病害入侵信使。

热激蛋白（HSP）是一大类分子伴侣蛋白，能够通过与抗性蛋白互作起到调控病害抗性的作用[19]。Martinelli等[20]研究发现HLB侵染诱导甜橙上热激蛋白表达显著下调，本研究结果也显示出CTV诱导甜橙多个热激蛋白点表达明显下调，推测可能引起了寄主蛋白的错折叠。

除了上述几种差异蛋白外，CTV还引起肽酰脯氨酰顺反式异构酶、变味蛋白、核酮糖 1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大小亚基、腺苷酸激酶、放氧复合物增强子蛋白、捕光叶绿素a/b结合蛋白前体、类叶绿素蛋白、类囊体内腔蛋白、似植物乳胶蛋白等的显著上调或下调表达。可见CTV的侵染影响到寄主各种复杂的生物学过程，其致病机理还有待进一步研究。（本文图版见插2）

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