基于TrnL—F序列的葡萄科各属分子特征及系统发育学研究

宫霞　王焕冲　杨勇　杨明挚

摘 要：【目的】探讨葡萄科内各属间系统发育关系，为该科植物的研究提供分子系统学方面的资料。【方法】以葡萄科14个属共计103个样品基于trnL-F的序列为材料，用Clustalx1.83软件分析各属的分子特征；并以五桠果属（Dillenia L.）为外类群，分别使用Mega，Paup，Phylip 常用的系统分析软件进行葡萄科各属间的分子系统学研究。【结果】结果表明，在GC含量方面，火筒树属含量最高，为35.12 %～35.44%，葡萄属含量最低，为32.98%～33.63%；葡萄科各属的trnL-F序列间存在着不同的序列差异，部分属具有显著的分子特征，可用于属间鉴定。【结论】应用Mega、Phylip和Paup系统分析软件的聚类结果表明，3种软件分析均支持将葡萄科分为5个分支，而其中Paup和Phylip软件构建的系统发育树较符合葡萄科基于形态学的系统学关系。

关键词： 葡萄科； TrnL-F序列； 分子特征； 系统发育关系

中图分类号：S663.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0028-09

葡萄科（Vitaceae）植物多为木质藤本，在白垩纪时期就已存在于地球，现在广泛分布于全球各地。葡萄科植物分类比较复杂，分类学家对属种的处理历来有分歧，世界属种数目随研究者不同而不同，总结起来全科约有14～16属700～850种[1]，其中我国有9属150多种，各省均产，而野生种主要分布在华中、华南及西南各省[2]。葡萄科的系统学研究较少，该科的系统学位置尚不确定，即便是在葡萄科内关于各属系统发育关系也不十分清楚。

叶绿体基因组（Choroplast DNA，cpDNA），其遗传方式为单亲遗传，具有较高的序列保守性，进化速率恒定等优点。TrnL-F序列是叶绿体基因组之一，该片段大小适中，不受功能限制，其进化速率大于功能编码区，能提供较多系统学意义的信息位点，在大麦属[3]，川续断目[4]等的系统学研究上已取得成功。因此被认为适应于研究植物属间的系统发育关系。在众多的生物分析软件中，Mega、Paup和Phylip软件常被用于系统发育的分析中。用Paup软件分析葡萄科[5-6]、伞形科系统发育关系[7]；用Mega软件分析葫芦科[8]、繁缕及其近缘种的亲缘关系分析[9]；用Phylip软件分析桫椤科系统发育关系[10]。我们选取这3种较常用的软件，基于葡萄科14个属植物的TrnL-F序列，研究葡萄科内属间关系并筛选出较适合葡萄科系统分析的TrnL-F 序列，为后续研究提供依据。

1 材料和方法

以属名拉丁文在GeneBank上检索，得到葡萄科14个属103条trnL-F序列，并选取五桠果科五桠果属（Dillenia L.）1条序列为外类群，总计104条序列（表1）。

对收集到的共计104条样品序列用Clustalx1.83软件进行完全比对，并进行适当的人工校正。排序后的序列分别使用Mega5、Paup4.0b4a和Phylip软件进行系统发育分析。均采用邻接法（NJ）构建系统树，各分支的置信度用自展检验法（bootstrap test）检验，共进行500次循环，以评价各支的系统学意义和可靠性。建立系统树时，始终以D. turbinata为外类群，空位（gap）始终作为缺失（missing）处理。

2 结果与分析

2.1 基于TrnL-F序列的葡萄科各属间的分子特征

所有序列经Clustalx1.83软件比对完后，计算所有序列的G+C含量，其中以火筒树属平均含量最高，为35.12%～35.44%，葡萄属平均含量最低，为32.98%～33.63%。

比对结果显示，属与属之间存在着各自特定的序列差异。既有单个碱基的差异，又有多个碱基的差异。Cyphostemma属与其余属相比，差异部位较多，共计28处，其次是火筒树属。而酸蔹莓属较特殊，尚未发现该属内部序列共有的差异位点。部分属的差异位点具有明显的特异性。如葡萄属有四段较大的序列缺失，分别是645-655处缺失“CTCTTTTCGTT”， 657-668处缺失“GCGGTTCAAAAT”，685-700处缺失“ATGTTTATCATTCACT”和719-730处缺失“AAAGGGATCCGC”。Cyphostemma属与其他属的差异位点较多，且缺失片段较大，如807～841处缺失“GATACGCGTACAAACGAACATCTTTGAGCAAGGA A” 和847～879处缺失“TCTTCATTTGAATGATTCA CAGTACATATCATT”等。不仅存在单个属特异的突变位点，还有多属共有一个差异位点的现象。例如，乌蔹莓属和崖爬藤属共有6处相同变异，其中5处又与Cyphostemma属变异相同。这种明显的序列特征或许可以在今后的植物鉴定上发挥作用。

2.2 系统进化

所得序列分别用Mega5、Paup4.0、Phylip软件构建系统进化树，以大花五桠果（D. turbinata）为外类群（图1～3）。可见，葡萄科所有序列为单起源，聚在一个分支上。在3种软件所建树中，大部分序列是以属为单位结合在一个分支上，整体上可以分为五大分支：火筒树属分支；地锦属-俞藤属分支；蛇葡萄属-Clematicissus属-Rhoicissus属分支；白粉藤属-乌蔹莓属-崖爬藤属-Cyphostemma属分支；酸蔹莓属-葡萄属-Nothocissus属-Pterisanthes属分支。

2.2.1 火筒树属分支 火筒树属，直立乔木或灌木，无卷须，花瓣基部联合并且与不育雄蕊管贴生。这些形态学特征与葡萄科的攀援木质藤本，有卷须等特征存在明显不同。因此有学者认为应将火筒树属从葡萄科中分离出来，独立成科[1，5，11-14]。然而，该属花两性，排列成聚伞花序，胚乳呈嚼烂状等形状与葡萄科基本特征相似，故有学者将其归于葡萄科内[2]。

3种软件中火桐树属的聚类结果是一致的，火筒树属单独聚在一个分支上，为单起源。不与葡萄科其他属交叉，亦和五桠果科保持独立。该支支持度很高，均为96%以上。图1中火筒树属与蛇葡萄属聚集，支持火筒树属放在葡萄科内。

2.2.2 地锦属-俞藤属分支 俞藤属，1990年建立的一个新属[15]，仅含3种，过去一直将该属放在地锦属中[11]，Soejima等[5]研究葡萄科3种序列构建的树中，将地锦属与俞藤属放在同一分支上，也有少数学者将其归到乌蔹莓属中。从光学显微镜下观察俞藤属和地锦属的表皮特征差异不大[1]，但在形态学上，俞藤属植物卷须二叉分枝，显著伸长，卷须顶端不膨大呈吸盘，而地锦属植物是卷须多总状多分支，遇到附着物后膨大成吸盘；俞藤属植物花序与叶对生，呈典型的复二歧聚伞花序，种子腹面两侧洼穴自基部向上达种子2/3处；而地锦属植物花呈多岐聚散花序，种子腹面两侧洼穴呈沟状从基部向上斜展到达种子顶端[2]。

地锦属在3种软件聚类结果中均分成两支，一支由来自亚洲的地锦种组成，与蛇葡萄属亲缘关系较近，支持度为69%；另一支由来自北美洲的地锦种组成，图1中这支与马来西亚的Ampelocissus filipes关系较近，图2和图3中与葡萄属聚在一支上，支持度较低。俞藤属由亚洲种组成，与地锦属分离，在图1中与第5分支聚在一起，图2、图3中，俞藤属均由地锦属的亚洲种分支分生而来。Paup和Phylip软件建树结果与形态学特征更相符，因此在分子系统学上支持俞藤属的独立。

2.2.3 蛇葡萄属-Clematicissus属-Rhoicissus属分支 Clematicissus属与Rhoicissus属是由Planchon等[11]于1887年首先提出的。Clematicissus属主要分布于澳大利亚西部，多年生落叶灌木，卷须二叉分枝，聚伞花序，花盘杯状，花柱呈锥形，具有块茎。Rhoicissus属是非洲的一个小属，植株较为瘦小，芽球状，其花序为聚伞花序，常有卷须，花两性或假两性，花瓣脱落时仍联合，但花盘贴生于子房上。

该支可分成三小支，Clematicissus属与Rhoicissus属各成一支，后与蛇葡萄属聚为一支，这一支在3种软件聚类结果中基本一致。

2.2.4 白粉藤属-乌蔹莓属-崖爬藤属-Cyphostemma分支 Cyphostemma属主要分布于热带和亚热带地区，常具羽状或3出复叶，花序腋生或近顶生，花芽瓶状，花盘具4个蜜腺，花柱不裂等特点。白粉藤属是葡萄科最早建立的两个属之一[2]，是葡萄科中较大的属。Soejima等[5]认为白粉藤属与非洲的Rhoicissus属距离较近，但在本研究中并没有体现出来。现已有很多研究支持乌蔹莓属与崖爬藤属分支[5，14，16]。

白粉藤属独立于该支其余序列，且与葡萄属亲缘关系较近。崖爬藤属与Cyphostemma属均从乌蔹莓属的一支中分离而来。乌蔹莓属在图1中分成两支；图2和图3中分三支，一支仅含有崖爬藤属，Cyphostemma属和部分乌蔹莓属序列，另外两支是全部由乌蔹莓属序列组成，与前一分支并列成姐妹分支。是否存在长期的地理隔离导致性状的不同，而形成新属，还有待进一步研究。

2.2.5 酸蔹莓属-葡萄属-Nothocissus属- Pterisanthes属分支 Nothocissus属分布于亚洲，是一个较小的属。Pterisanthes属是分布于马来西亚，菲律宾等东南亚地区，其特点是具有扁平带状的圆锥花序，花序与叶对生，卷须分叉，2者均生于花梗处。酸蔹莓属分布于亚洲南部、非洲、大洋洲和中美洲。Wen等[17]研究葡萄科GAI1基因得出结论，在没有得到Nothocissus属序列时，酸蔹莓属与Pterisanthes属距离较近。在葡萄科，葡萄属的起源问题存在较大争议，多数研究指明葡萄属为单起源属，而Ingrouille等[14]从rbcL序列方面研究认为葡萄属是多起源属。本文3种树都支持葡萄属为多起源。

该支在3种树中支持度都很低。Pterisanthes属并没有聚成一支，Nothocissus属与酸蔹莓属亲缘关系较近。图1中酸蔹莓属与Nothocissus属、Pterisanthes属、葡萄属部分序列混杂排列在一支。图2和图3中除葡萄属有少数序列与白粉藤属聚在一起，其余酸蔹莓属与葡萄属均按属各自聚成一支。

3 讨 论

本文运用Mega5、Paup4.0、Phylip 3种软件对葡萄科14属103条trnL-F序列进行系统发育学研究，从亲缘关系上大致可分为5大分支：火筒树属分支；地锦属[18]-俞藤属分支；蛇葡萄属-Clematicissus属-Rhoicissus属分支；白粉藤属-乌蔹莓属-崖爬藤属[19]-Cyphostemma属分支；酸蔹莓属-葡萄属-Nothocissus属-Pterisanthes属分支。

在分子系统学方面，国内外学者对葡萄科亲缘关系的研究结果并不一致。Rossetto等[20]对澳大利亚葡萄科三属26个种trnL内含子序列的研究认为崖爬藤属是单系群，而乌蔹莓属的2个姊妹群、白粉藤属和葡萄（V. vinifera）则为一个多系群；Rossetto等[21]对葡萄科四属8个种EST-SSRs标记结果表明，乌蔹莓属和崖爬藤属亲缘关系较近，白粉藤属则和葡萄亲缘关系较近；Wen等[17]以火筒树属（Leea L.）为外类群，对葡萄科10属103条核GAL1系统发育分析表明，亲缘关系为乌蔹莓属-崖爬藤属-Cyphostemma属分支，葡萄属-酸蔹莓属（热带）-Pterisanthes属分支，地锦属-俞藤属分支，酸蔹莓属（亚洲）-Pterisanthes属（东南亚），其中蛇葡萄属分羽状、掌状两亚支，与白粉藤属（C. striata complex）、Rhoicissus属（非洲）为并系群，白粉藤属（C. striata complex除外）则为单系群。

对比这些研究结果，与本文最大的区别在于白粉藤属和葡萄属的系统学位置。差异的原因可能在于叶绿体基因在进化方向的分析方面存在着一定的局限性[9]，如进化速率远低于核基因组序列，再加上白粉藤属本身又较为复杂，所以要确定白粉藤属和葡萄属的亲缘关系还需进一步研究。

在形态系统学方面，基本是一个先发现鉴定、后纠正补充的趋势。1936年，恩格勒系统将火筒树属置于葡萄科[2]，1997年Takhtajan则主张将其独立成火筒树科。1990年李朝銮[2]将分布于中国亚热带、尼泊尔和印度卡西山区一些植物物种从地锦属中分出单独成为俞藤属。其中俞藤属和地锦属雄蕊5枚，花盘发育不明显，而酸蔹莓属的雄蕊4～5，花盘发达[2]，可见俞藤属与地锦属亲缘关系较近；而白粉藤属和乌蔹莓属卷须不分枝或2～3叉分枝，稀总状多分枝，花4数，花瓣各自分离脱落，而葡萄属花5枚，花瓣凋谢时呈帽状粘合脱落，种子2～4颗[2]，可见白粉藤属与乌蔹莓属亲缘关系较近。任辉等[1]对葡萄科11属37个代表种叶表皮气孔类型观察，发现地锦属、俞藤属、葡萄属、蛇葡萄属、Muscadinia和酸蔹藤属特征相似，乌蔹莓属、Rhoicissus、白粉藤属和崖爬藤属特征相似。

对比3种软件建树的结果，最大的区别在于俞藤属和白粉藤属的系统位置。Paup和Phylip软件建树结果较为符合葡萄科形态学上的特征，更适合用于葡萄科系统进化树的构建。

参考文献 References：

[1] REN Hui，PAN Kai-yu，CHEN Zhi-rui，WANG Ren-qing. Structural characters of leaf epidermis and their systematic significance in Vitaceae[J]. Acta Phytotaxonomica Sinica，2003，41（6）： 531-544.

任辉，潘开玉，陈之端，王仁卿. 葡萄科植物叶表皮特征及其系统学意义[J]. 植物分类学报，2003，41（6）： 531-544.

[2] LI Chao-luan. Flora[M]. Beijing： Science Press，1998.

李朝銮. 中国植物志[M]. 北京： 科学出版社，1998.

[3] NISHIKAWA T，SALOMON B，KOMATSUDA T，VOR BOTHMER R，KADOWAKI K-I. Molecular phylogeny of the genus Hordeum using three chloroplast DNA sequences[J]. Genome，2002，45： 1157-1166.

[4] ZHANG W H，CHEN Z D，LI J H，CHEN H B，TANG Y C. Phylogeny of the Dipsacales s.l. based on chloroplast trnL-F and ndhF sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，26： 176-189.

[5] SOEJIMA A，WEN J. Phylogenetic analysis of the grape family （Vitaceae） based on three chloroplast markers[J]. American Joumal of Botany，2006，93（2）： 278-287.

[6] ROSSETTO M，CRAYN DM，JACKES BR，CAROLYN P. An updated estimate of intergeneric phylogenetic relationships in the Australian Vitaceae[J]. Canadian Journal of Botany，2007，85： 722-730.

[7] NEVES SS，WATSON MF. Phylogenetic relationships in Bupleurum （Apiaceae） based on nuclear ribosomal DNA ITS sequence data[J]. Annals of Botany，2004，93： 379-398.

[8] JOBST J，KING K，HEMLEBEN V. Molecular evolution of the internal transcribed spacers （ITS1 and ITS2） and phylogenetic relationships among species of the family Cucurbitaceae[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，1998，9（2）： 204-219.

[9] ZHAO Hai-guang，ZHOU Jian-jian，CAO Shan-shan，ZHENG Yu-hong，SHAN Yu，XIA Bing. Analysis of interspecific relationship among Stellaria media and its related species based on ITS and trnL-F sequence differences[J]. Journal of Plant Resources and Environment，2009，18（1）： 1-5.

赵海光，周建建，曹珊珊，郑玉红，单宇，夏冰. 基于ITS和trnL-F 序列碱基差异的繁缕及其近缘种的亲缘关系分析[J]. 植物资源与环境学报，2009，18（1）： 1-5.

[10] WANG Ting，SU Ying-juan，ZHENG Bo，LI Xue-yan，CHEN Guo-pei，ZENG Qing-lu. Phylogenetic analysis of the chloroplast trnL intron and trnL-trnF intergenic spacer sequences of the Cyatheaceae plants from China[J]. Journal of Tropical and Subtropical Botany，2003，11（2）： 137-142.

王艇，苏应娟，郑博，李雪雁，陈国培，曾庆璐. 中国桫椤科植物叶绿体trnL内含子和trnL-trnF基因间隔区序列的系统发育分析[J]. 热带亚热带植物学报，2003，11（2）： 137-142.

[11] PLANCHON J E. MONOGRAPHIE D E S AMP？魪LID？魪ES VRAIS. In： De Candolle AFPP， and De Candolle C （ed）， Monographiae Phanaerogamarum[M]. Paris： Masson，1887： 305-654.

[12] RIDSDALE C E. A revision of the family Leeaceae[J]. Blumea，1974， 22： 57-100.

[13] SHETTY BV，SINGH P. Vitaceae. In SINGH N P，VOHRA J N，HAJRA P K，SINGH D K. Flora of India. Botanical Survey of India[M]. India： Calcutta，2000： 246-324.

[14] INGROUILLE M J，CHASE M W，FAY M F，BOWMAN D，BANK M，BRUIJN A. Systematics of Vitaceae from the viewpoint of plastid rbcL DNA sequence data[J]. Botanical Journal of the Linnean Society，2002，138： 421-432.

[15] LI Chao-luan. Yua C. L. Lia A new genus of Vitaceae[J]. Acta Botanica Yunnanica，1990，12（1）： 1-10.

李朝銮. 俞藤属-葡萄科一新属[J]. 云南植物研究，1990，12（1）： 1-10.

[16] ROSSETTO M，JACKES B R，SCOTT K D，HENRY R J. Is the genus Cissus （Vitaceae） monophyletic？Evidence from plastid from and nuclear ribosomal DNA[J]. Systematic Botany，2002，27： 522-533.

[17] WEN J，NIE ZL，SOEJIMA A，MENG Y. Phylogeny of Vitaceae based on the nuclear GAI1 gene sequences[J]. Canadian Journal of Botany，2007，85： 731-745.

[18] NIE Z L，SUN H，CHEN Z D，MENG Y，MANCHESTER S R，WEN J. Molecular phylogeny and biogeographic diversification of Parthenocissus （Vitaceae） disjunct between Asia and North America[J]. American Journal of Botany，2010，97： 1342-1353.

[19] CHEN P T，CHEN L Q，WEN J. The first phylogenetic analysis of Tetrastigma （Miq.） Planch.， the host of Rafflesiaceae[J]. International Association for Plant Taxonomy，2011，60： 499-512.

[20] ROSSETTO M， JACKES B R，SCOTT K D，ROBERT J. HenryIntergeneric relationships in the Australian Vitaceae： new evidence from cpDNA analysis[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2001，48： 307-314.

[21] ROSSETTO M， MCNALLY J， HENRY R J. Evaluating the potential of SSR flanking regions for examining taxonomic relationships in the Vitaceae[J]. Theor Appl Genet，2002，104： 61-66.