五叶草莓超低温保存及遗传稳定性分析

朱文涛　周厚成　王子成

摘 要：【目的】为了找出野生种质资源五叶草莓（Fragaria pentapylla）的超低温保存方法和分析超低温保存后五叶草莓的遗传信息稳定性，【方法】运用玻璃化法对五叶草莓离体茎尖超低温保存技术进行了研究，并采用AFLP和MSAP技术对其遗传稳定性作了探讨。【结果】结果表明，不同的低温锻炼时间、预培养时间、预处理时间、玻璃化溶液（PVS2）处理时间和液氮保存时间对五叶草莓超低温保存后成活率的影响各不相同，经优化后，低温锻炼3周，预培养3 d，预处理30 min，PVS2处理60 min时，超低温保存的最高成活率可达79.7%，液氮处理时间对成活率影响不明显；运用AFLP技术对超低温后成活生长120 d的材料及对照材料基因组DNA进行了分析，超低温前后带型一致，未发现明显差异片段；进一步用MSAP技术分析了超低温保存后成活的材料和对照材料DNA甲基化水平差异，结果表明超低温保存后五叶草莓DNA甲基化与去甲基化分别为5.70%和12.43%。【结论】玻璃化法超低温保存技术可以有效的保存五叶草莓种质资源，超低保存前后的五叶草莓基因组DNA没有发生多态性变化，但DNA甲基化水平降低。

关键词： 五叶草莓； 超低温保存； 玻璃化法； 遗传稳定性； 甲基化

中图分类号：S668.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0055-07

栽培种凤梨草莓（Fragaria ananassa Duch.）是一种营养价值与经济价值较高的园艺作物，目前被视为一种经济植物而被广泛栽培[1]。由于野生草莓具有广泛的适应性和多种优良特性，例如：风味品质、抗病、抗虫和抗不良环境胁迫等，通常作为栽培种草莓改良的重要材料[1-3]。五叶草莓（Fragaria pentapylla），也叫泡儿，秧泡儿，原产我国，是我国丰富的野生草莓资源的一种[4]，它具有抗寒、抗病性强、果实香味浓等特点，是进行栽培种培育和改良的理想亲本。同时，五叶草莓属于二倍体草莓，染色体数目少[5]，基因组小得多，使其成为蔷薇科植物基因功能研究中有应用潜力的良好材料。五叶草莓以及野生草莓都是宝贵的野生资源，然而目前没有一种有效的手段使其种质资源得到长期保存。

上世纪70—80年代建立起的超低温保存技术对种质资源保存具有重要的意义[6-7]。超低温保存技术是将植物材料保存在-80 ℃及其以下，使细胞内的物质代谢与生长活动近乎停止，处于“生机停顿”（suspended animation）状态，从而实现植物材料的长期保存。目前，进行超低温保存的方法有多种[6-7]，主要是玻璃化法、包埋干燥法、包埋玻璃化法、小滴玻璃化法等。然而，植物在超低温保存过程中，会涉及到一系列的胁迫[8]，这些胁迫有可能对其遗传的稳定性产生一定的影响。近年来，许多学者就超低温保存后再生材料的遗传稳定性问题做了大量的研究和分析，主要集中在：（1）超低温保存材料的基因组遗传稳定性研究；（2）超低温保存再生材料的表观遗传信息变异情况分析等方面[8]。在基因组稳定性方面，许多学者运用了AFLP[9]、RAPD等多种技术对材料的基因组进行了分析，袋鼠花（Anigozanthos viridis）[10]、苹果[11]、拟南芥[12]、椰子（Cocos nucifera L.）[13]等大部分研究都证明了超低温之后基因组没有发生改变，但是在冷杉[14]、木瓜[14-15]等少数研究中却发现其基因组改变的现象。对超低温保存中的DNA甲基化变化的研究中，发现苹果[10]、木瓜[15]、蛇麻草（Humulus lupulus）[16]、拟南芥[17]、虎耳草科酷栗属[18]等不同基因型的植物材料经过超低温保存后甲基化水平均发生了不同程度的变化。我们采用玻璃化法对五叶草莓进行了超低温保存，运用AFLP技术对超低温保存前后五叶草莓材料的基因组信息进行分析，以确定五叶草莓材料超低温保存后基因组遗传稳定性是否良好，同时运用MSAP技术对超低温前后的五叶草莓的DNA甲基化水平进行分析，探讨五叶草莓超低温前后的甲基化水平变化以及变化趋势，以期为完善超低温保存后五叶草莓的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

以河南大学植物种质资源及遗传实验室提供的五叶草莓 （F. pentapylla） 幼苗为实验材料，五叶草莓采自秦岭地区。

1.2实验方法

1.2.1 组织培养体系的建立 自田间选取五叶草莓健壮的匍匐茎，取1.5～3.0 cm长的顶芽，采用常规方法进行清洗和消毒，选用MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1作为五叶草莓诱导培养基，MS+6-BA 0.5 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1作为继代培养基，培养出大量的五叶草莓组培苗。

1.2.2 超低温保存过程 采用的超低温方法为玻璃化法[17，19]，该方法在前人的基础上加以改良，其具体的操作流程为：首先，将继代培养25 d的试管苗置于4 ℃冰箱低温锻炼，并设置时间梯度为0、1、2、3、4、5周，记录植株生长情况；其次，取低温锻炼后的试管苗，在无菌条件下切取茎尖约5 mm，将其置于预培养培养基（MS +0.4 mol·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂，pH=5.8）中4 ℃预培养，培养时间为0、1、2、3、4 d；然后，将茎尖转入加有液体预处理培养基的无菌冷冻管中20 ℃预处理，每管15个茎尖，预处理时间0、10、20、30、40 min；然后用无菌胶头滴管吸出预处理液，加入玻璃化溶液PVS2（MS+30%（w/v）甘油+15%（w/v）乙二醇+15%（w/v）DMSO+0.4 mol·L-1）0 ℃处理0、20、40、60、100 min；接下来，将冷冻管放入纱布袋并迅速投入液氮中保存1、7、14 d；最后，将材料快速取出，42 ℃水浴化冻处理2～3 min，在超净工作台下吸去冷冻保护液，用含有1.0 mol·L-1蔗糖的MS洗涤液将茎尖洗涤3次，每次10 min，并接种到恢复培养基上进行培养（培养条件：温度 （24±1）℃，光照12 h·d-1），21～25 d统计数量并计算成活率。

试验重复3次，求平均成活率。计算公式为：

成活率（%）=（玻璃化超低温保存后成活的茎尖数/保存的总茎尖数）×100

1.2.3 五叶草莓超低温保存前后AFLP分析 采用改良的CTAB法[20]提取五叶草莓总DNA， -20 ℃保存备用。AFLP分子标记技术的实验程序主要参照Turner等[10]和郝玉金等[11]的AFLP程序，引物设计如表1。AFLP分子标记技术主要包括以下几个过程：选用限制性内切酶EcoRI/MseI对目的基因组DNA进行双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测。

1.2.4 超低温前后五叶草莓DNA甲基化变化MSAP分析 利用MSAP技术分析基因组的DNA甲基化变化，此方法主要参照Cervera等[21]与何艳霞等[17]的方法，引物设计如表1。该方法在AFLP的基础上用对甲基化敏感的MspⅠ和HapⅡ代替AFLP分子标记中的高频酶MseⅠ，然后用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ的组合对目的DNA进行酶切，酶切产物随后进行连接、预扩增、选择性扩增、电泳及银染，其操作过程和程序与上述AFLP分析的操作一致。

2 结果与分析

2.1 超低温保存结果与分析

2.1.1 低温锻炼对超低温保存后茎尖成活率的影响

对五叶草莓低温锻炼时间不同，其超低温保存后成活率也会受到不同程度的影响，低温锻炼能明显影响保存后茎尖存活率。如图1所示锻炼21 d时存活率为最高值51.9%，随着锻炼时间的延长，成活率出现下降趋势。在低温锻炼期间观察发现经过28 d后试管苗叶片逐渐变成黄褐色，保存后再生材料存活率也有所下降。

2.1.2 固体预培养对超低温保存成活率的影响 用固体预培养培养基对五叶草处理的时间不同，则超低温保存后成活率的影响也不同。固体预培养能明显影响保存后茎尖存活率，如图2所示固体预培养时间为3 d时存活率为61.5%。低温锻炼3周的苗在只改变固体预培养时间的条件下，其他条件限定在液体处理时间20 min，pvs2处理时间60 min，超低温处理时间1 d，固体预培养为3 d。

2.1.3 液体处理培养基对超低温保存成活率的影响

对五叶草莓液体进行不同时间的处理，则其超低温保存后成活率影响也不同，液体处理时间能明显影响保存后茎尖存活率。液体预处理随着时间的增加，成活率表现为先增加后减小的趋势，在处理30 min时成活率最高，达到79.7%（图3）。

2.1.4 PVS2处理对超低温保存成活率的影响 超低温玻璃化过程是对保存起着至关重要的作用，冰冻保护剂PVS2处理使茎尖内组织进一步脱水则是玻璃化过程中极为关键的一步。结果表明（图4）PVS2处理60 min时的茎尖成活率为79.7%，达到最高，时间过短或更长都不利于茎尖的成活和再生。这很可能是由于时间过短导致的玻璃化不完全，从而在冻存过程中植物茎尖受到损伤。当处理时间高于60 min时，由于PVS2本身对材料有毒害作用，进而导致茎尖存活率下降。

2.2 超低温前后的AFLP分析结果

应用AFLP技术对超低温保存前后的五叶草莓材料进行检测分析，14对引物共扩增出可统计条带526条，部分条带如图5所示，在超低温保存前后的五叶草莓材料之间没有出现多态性位点。说明对照与超低温处理样品之间基因组序列保持一致，没有发生该方法可以检测到的遗传变异。

2.3 超低温前后的MSAP分析

HpaⅡ和MspⅠ是一组均识别并切割5CCGG 3 序列的同裂酶，HpaⅡ对胞嘧啶的甲基化极其敏感，它不能切割任何一个或两个均甲基化的序列，能够识别切割单链发生甲基化。MspⅠ对内部胞嘧啶的甲基化是不敏感的，对外部胞嘧啶的甲基化则很敏感。因此，超低温处理和对照五叶草莓材料提取的DNA经HpaⅡ/EcoRⅠ（H）和MspⅠ/EcoRⅠ（M）酶切后的产物通常有4种甲基化类型，但是，在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上只能检测出3种甲基化类型（图6）。其中，类型Ⅰ表明CCGG位点没有发生甲基化变化，类型Ⅱ表明CCGG位点发生了半甲基化，类型III表明CCGG位点发生了全甲基化。为了检测五叶草莓经过超低温处理后DNA甲基化的模式，利用不同的引物组合（表1）对超低温处理样品及对照组的基因组DNA进行MSAP分析。由表2可知，经超低温处理后五叶草莓全基因组DNA胞嘧啶甲基化水平降低，且全甲基化率高于半甲基化率。

本实验一共利用12种不同引物组合对五叶草莓超低温保存前后的DNA双酶切产物进行选择性扩增，并对扩增结果进行分析，发现扩增结果共出现12种带型（表3），这些带型又分为多态性和单态性2种。多态性又有3种状态即甲基化（A型）、去甲基化（B型）以及不定类型（C型），表明CCGG位点甲基化状态在超低温处理之后发生不同的改变。A型中的A1和A2为重新甲基化（对照H和M泳道均有条带，而处理仅H或M泳道有条带），A3和A4为超甲基化（对照仅H或M有一条带，而处理H和M泳道均无带）。A型表明超低温处理诱导五叶草莓基因组DNA发生了甲基化水平增加的变化；B型含B1、B2、B3和B4，为去甲基化类型，甲基化状态与A型相反，表明超低温处理后基因组DNA发生了甲基化水平下降的变化；C型为不定类型，对照组与处理组中DNA甲基化程度的差异无法确定。单态性即对照与处理之间有相同的带型 （D型），表明低温处理后CCGG位点的甲基化状态没发生变化。其中，D1型为未甲基化，D2和D3为半甲基化。处理与对照的甲基化模式带型A、B、C和D及相应的位点数见表3。

由表4可知，超低温处理的五叶草莓基因组DNA甲基化（A型）位点数为11，占总甲基化多态性扩增位点数的5.70%；去甲基化（B型）位点数为24，占总甲基化多态性扩增位点数的12.43%。与对照相比，超低温处理后的总甲基化多态性为19.17%，甲基化状态未发生变化（D型）的比率为80.83%。

由此推测，经超低温处理后五叶草莓基因组DNA的甲基化与对照相比发生了变化，总甲基化比率降低；在扩增的甲基化位点中，去甲基化的位点数高于发生甲基化的位点数，同时基因组DNA甲基化多态性也随之增加。

3 讨 论

研究首次利用玻璃化法对五叶草莓材料进行了超低温保存试验，经研究发现：低温锻炼3周，能明显提高五叶草莓茎尖超低温保存的存活率；固体预培养基中加入甘油对五叶草莓的成活率影响非常大，去除甘油后五叶草莓的成活率明显提高，固体预培养3 d，能明显提高成活率；液体预处理时间为30 min时，对五叶草莓的超低温保存最为有利； PVS2处理是超低温保存过程中的关键步骤，缺少或处理时间不当对保存后茎尖成活率存在显著影响。试验中发现，PVS2处理时间并不是越长越好，当处理时间为60 min时存活率达到最高。同时发现，液氮冻存时间对超低温保存五叶草莓的存活率并无显著影响，成活率并未产生太大变化，郝玉金等[11]、李俊慧等[19]的研究相符，说明超低温保存技术可以作为五叶草莓种质资源保存的可靠技术。

AFLP技术是检测DNA多态性常用的技术，本实验采用14对引物共扩增出可统计条带526条带，没有出现多态性位点，说明对照与超低温处理样品之间基因组序列保持一致，这与Turner等[10]、郝玉金等[11]的研究结果相似，说明玻璃化法超低温保存技术可以作为五叶草莓种质资源保存的有效手段。

MSAP技术是分析基因组甲基化多态性的一项常规技术，本实验数据显示，超低温处理对五叶草莓的甲基化有一定程度的影响，与对照相比，甲基化水平发生了变化，DNA甲基化位点数占总甲基化多态性扩增位点数的5.70%；去甲基化位点数占总甲基化多态性扩增位点数的12.43%。结果表明玻璃化法超低温保存成活的五叶草莓甲基化水平降低了6.73%，这与木瓜[15]、蛇麻草（Humuluslupulus）[16]、拟南芥[17]等植物超低温保存后的甲基化变化趋势相类似。这种变化趋势可能是植物对超低温保存这种逆境处理的一种遗传适应，其内在机制目前未明，需要进一步的深入探讨。

4 结 论

玻璃化法超低温技术作为一种有效的植物种质资源超低温保存方法，可以用于五叶草莓种质资源的保存，这样不仅使其保存后的成活率达到了一个比较高的水平，且超低保存前后五叶草莓基因组DNA多态性并无发生变化。但是研究表明超低保存前后的五叶草莓基因组DNA甲基化水平发生了一定的变化，因此我们需要深入研究甲基化水平的变化对五叶草莓在生理生化方面带来的影响。

参考文献 References：

[1] QIN Yong-hua， ZHANG Shang-long. Recent advances in strawberry tiansgenic research[J]. Hereditas， 2007， 29（2）： 150-156.

秦永华，张上隆. 草莓转基因研究进展[J]. 遗传， 2007，29（2）：150-156.

[2] KANG Hou-xiang， JIANG Feng， YANG Guo-shun. Progress in transgene of strawberry[J]. Biotechnology Bulletin， 2006（Suppl.）：67 -69

康厚祥，姜丰，杨国顺. 草莓转基因研究进展[J]. 生物技术通报，2006（增刊）： 67-69.

[3] NOGUCHI Y， MOCHIZUKI T，SONE K. Breeding of a new aromatic strawberry by interspecific hybridization Fragaria ananassa× F. nilgerrensis[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science， 2002， 71（2）： 208-213.

[4] MA Hong-xiang， CHEN Pei-du. Advances in research of using wild strawberry species with lower ploidy in strawberry breeding[J]. Journal of Fruit Science， 2003，20（4）： 305-309.

马鸿翔，陈佩度. 草莓属低倍性野生资源在育种中利用的研究进展[J]. 果树学报，2003， 20（4）： 305-309.

[5] LEI Jia-jun， YANG Gao， DAI Han-ping， WU Lu-ping， DENG Ming-qin. Chinas strawberry wild germplasm resources[J]. Journal of Fruit Science，1997，14（3）198-200.

雷家军， 杨 高， 代汉萍， 吴禄平，邓明琴. 我国的草莓野生种质资源[J]. 果树科学， 1997，14（3）： 198-200.

[6] XU Ding-hua，XIANG Jun，XU Xia-ling，ZHANG Qing-lin. Cryopreservation of plant germplasm resources[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，2007， 35（2）： 321-323.

徐定华， 项俊， 徐霞玲，张青林. 超低温保存技术在植物种质资源研究中的应用[J]. 安徽农业科学， 2007，35（2）： 321-323.

[7] ZHONG Lan， LIU Yu-ping， PENG Jing. Plant germplasm resources in vitro preservation technology research[J]. Journal of Changjiang Vegetables，2009（16）： 4-7.

钟兰， 刘玉平， 彭静.植物种质资源离体保存技术研究进展[J]. 长江蔬菜， 2009（16）： 4-7.

[8] SHAO Li，WANG Zi-cheng. Review of genetic stability research for plant germplasm cryopreservation[J]. Plant Physiology Communications， 2010，11（46）： 1109-1113.

邵丽，王子成. 植物种质超低温保存遗传稳定性的研究进展[J].植物生理学通讯，2010，11（46）： 1109-1113.

[9] LI Shan，ZHAO Gui-fang. AFLP molecular marker and its application[J]. Acta Botanica Boreali-occidentalia Sinica，2003，23（5）： 830 -836.

李珊， 赵桂仿. AFLP分子标记及其应用[J]. 西北植物学报， 2003， 23（5）： 830-836.

[10] TURNER S， KRAUSS SL， BUNN E. Genetic fidelity and viability of Anigozonihosiridis following tissue culture， cold storage and cryopreservation[J]. Plant Science， 2001， 161： 1099-1106.

[11] HAO Yu-Jin， LIU Qun-Long， DENG Xiu-Xin. Effect of cryopreservation on apple genetic resources at morphological， chromosomal and molecular levels[J]. Cryobiology， 2001，43： 46-53.

[12] BASU C. Gene amplification from cryopreserved Arabidopsis thaliana shoot tips[J]. Curr Issues Mol Biol， 2008， 10： 55-60.

[13] SISUNANDA R， RIVAL A， TURQUAY P， SAMOSIR Y，ADKINS S W.Cryopreservation of coconut （Cocos nucifera L.） zygoticembryos does not induce morphological， cytological or molecular changes in recovered seedlings[J]. Planta， 2010， 232： 435-447.

[14] ARONEN T S， KRAJNAKOVA J， HAGGMAN H M， RYYNANEN L A. Geneticfidelity of cryopreserved embryogenic cultures of open-pollinated Abies cephalonica[J]. Plant Science，1999， 142： 163-172.

[15] KAITY A， ASHMORE S E， DREW R A， DULLOO M E. Assessment of genetic and epigenetic changes following cryopreservation in papaya[J]. Plant Cell Rep， 2008，27： 1529-1539.

[16] PEREDO E L， ARROYO-GARCIA R， REED B M， REVILLA M A. Genetic and epigenetic stability of cryopreserved and cold storedhops （Humulus lupulus L.）[J]. Cryobiology， 2008，57： 234-241.

[17] HE Yan-xia，WANG Zi-cheng. Variation of DNA methylation in arabidopsis thaliana seedlings after the cryopreservation[J]. Chinese Bulletin of Botany，2009，44（3）： 317-322.

何艳霞， 王子成.拟南芥幼苗超低温保存后DNA甲基化的遗传变异[J]. 植物学报， 2009，44（3）： 317-322.

[18] JOHNSTON J W， BENSON E E， HARDING K. Cryopreservation induces temporal DNA methylation epigenetic changes and differential transcriptional activity in Ribes germplasm[J]. Plant Physiol Biochem，2009，47： 123-131.

[19] LI Jun-hui， HE Ping， CHEN Xiao-ling， LU Xin-xiong， XIN Xia， ZHANG Zhi-e， XIN Ping-ping. Cryopreservation of in vitro shoot-tips of banana（Musa spp.）[J]. Journal of Plant Genetic Resources，2010， 11（1）： 34-39.

李俊慧， 何平， 陈晓玲， 卢新雄， 辛霞， 张志娥， 辛萍萍.香蕉离体茎尖超低温保存研究[J]. 植物遗传资源学报， 2010，11（1）： 34-39.

[20] MICHELI M R， BOVA R， PASCALE E， AMBROSIO D. Reproducible DNA fingerprinting with the random amplified polymorphic DNA （RAPD） method[J]. Nucleic Acids Res，1994， 22： 1921-1922.

[21] CERVERA M， RUIZ-GARCIA L， MARTINEZ-ZAPATER J. Analysis of methylation in Arabidopsis thaliana based on methylation-sensitive AFLP markers[J]. Mol Genet Genomics，2002，268： 543-552.