BRC肽结构及与生物大分子的相互作用研究方法

马 丽，张雅峥，卢 奎,2

(1.河南工业大学 化学化工学院,河南 郑州 450001； 2.河南工程学院 材料与化学工程学院,河南 郑州 450007)

近年来，乳腺癌在女性中的发病率较高，每年约有7.9万新增乳腺癌患者，占女性恶性肿瘤的比例最高，对女性健康造成了严重威胁.目前，人们对于一些抑癌基因与DNA的相互作用机制已经较为清楚[1]，但对有关BRCA2基因中关键肽段BRC与靶肽之间相互作用的研究较少.BRC肽与靶肽之间的相互作用，可能直接影响乳腺癌的发病率，所以研究二者的相互作用模式和机制对乳腺癌的治疗有着重要意义[2-3].

1 BRCA2结构特征及类BRC肽设计

乳腺癌易感基因2(BRCA2)是一种重要的抑癌基因，定位于13号染色体长臂12～13区，可参与多种基因表达的调节，是修复DNA损伤的一种关键蛋白，其在蛋白库的编号(PDB ID)为1NOW.已有研究表明，多数乳腺癌患者体内的BRCA2发生突变，故BRCA2与乳腺癌有直接关系[4].当基因突变产生异常时，BRCA2蛋白失去活性不能行使其功能，最终导致乳腺癌的发生[5].在双链DNA断裂修复的过程中，BRCA2起着关键作用.BRCA2在行使其功能时，通过与RAD51的相互作用达到DNA修复效果[6].从其分子结构上看，BRCA2基因包含着高比例的重复序列，这在人类基因中是十分罕见的.这种高度重复的DNA序列可以导致基因组的不稳定和重排，最终导致基因产物的缺乏而产生癌症.BRCA2基因包含了3 418个氨基酸残基，其中有8个序列高度保守的重复基元(BRC1～BRC8)，每个重复基元均含有35个氨基酸残基:

BRC1: NHSFGGSFRTASNKEIKLSEHNIKKSKMFFKDIEE

BRC2: NEVGFRGFYSAHGTKLNVSTEALQKAVKLFSDIEN

BRC3: FETSDTFFQTASGKNISVAKESFNKIVNFFDQKPE

BRC4: KEPTLLGFHTASGKKVKIAKESLDKVKNLFDEKEQ

BRC5: IENSALAFYTSCSRKTSVSQTSLLEAKKWLREGIF

BRC6: FEVGPPAFRIASGKIVCVSHETIKKVKDIFTDSFS

BRC7: SANTCGIFSTASGKSVQVSDASLQNARQVFSEIED

BRC8: NSSAFSGFSTASGKQVSILESSLHKVKGVLEEFDL

多种癌症细胞中都存在这些重复基元，表明BRC为BRCA2的重要功能区[7].研究结果表明，8个BRC重复基元具有一定规律的结构，都含有以下保守序列：

-------F-TASGK-(I/V)-(I/V)S---L-K----(L/F)-(D/E)---

其中,每个“-”代表一个氨基酸残基，其余位点氨基酸符合以上规律[8].考虑到个别氨基酸的化学性质以及肽链形成二级结构的倾向，对保守序列中某些特定位点的“-”进行改造，就可以得到与靶肽相互作用更强的类BRC肽[9].对BRC肽进行结构改造时，需要根据氨基酸侧链的结构、性质，遵循一定原则进行设计.已有文献报道，侧链带有-NH2,-COOH和苯环的氨基酸性质较为活泼，容易与靶肽产生更强的相互作用[10]，所以将重复基元BRC中的某一个或者某一类氨基酸替换成侧链性质活泼的氨基酸，则可以得到相互作用更强的类BRC肽[11-12].

2 p 53基因结构特点

p53是人体中研究较多的抑癌基因产物，其蛋白库编号为1TUP，有肿瘤抑制器之称.p53具有重要的生理功能，它在行使功能时需要BRCA2及其产物的调控[13-14].在p53中，包含5个高度保守的区域(13～19，117～142，171～192，236～258，270～286)[15]，它们的突变会使细胞分裂紊乱.以p53(117～142，171～192)为例，序列分别为GTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCP与EVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQ.这些关键肽段由不同的氨基酸通过肽键连接，某些位点上的氨基酸由于其侧链结构的性质，导致该位点成为与BRCA2相互作用强弱的关键位点，若这些位点上的氨基酸发生突变，则可导致该保守区域的肽段与目标肽链相互作用强弱发生明显改变[16-17].因此，研究这些关键位点可为了解其行使功能的模式提供有用信息，进而为发现治疗癌症的肽类药物提供新的思路[18].

3 RAD51基因结构特点

RAD51是一种重要的DNA修复蛋白，蛋白库编号为1B22，是研究较为广泛的抑癌基因产物.RAD51在行使其功能时也受到了BRCA2的调控，已有的RAD51-BRC4晶体结构显示，RAD51某些位点上的关键氨基酸与BRC4存在着相互作用，如第205位上的Tyr，第247位上的Arg和第251位上的Met，这些关键位点上的氨基酸残基与类BRC肽上的Phe和Glu作用较强.如果这些关键位点发生突变，就会导致该基因失活，从而导致癌症生成.RAD51中191～220和231～260为关键肽段，其序列为YARAFNTDHQTQLLYQASAMMVESRYALLI和DYSGRGELSARQMHLARFLRMLLRLADEFG，将这些关键肽段作为靶肽，研究其与类BRC肽相互作用的基本化学规律将具有重要意义[19].

4 类BRC肽与靶肽及其他生物大分子相互作用的主要研究方法

在类BRC肽行使其功能时，需要与靶肽或其他生物大分子相互作用，由于某些位点上氨基酸侧链的性质不同，导致二者相互作用的强度不同；当氨基酸残基侧链中芳环所处的环境不同时，其相互作用强度也将发生变化.因此，可以从作用时间、温度、浓度等方面研究它们相互作用的方式和作用规律[20].常用的研究方法主要有紫外-可见吸收光谱法、荧光光谱法和圆二色光谱法.

4.1 紫外-可见吸收光谱法

紫外-可见吸收光谱是研究生物大分子之间相互作用的一种常用方法，它的特点是操作简便、现象直观.利用紫外-可见吸收光谱法研究类BRC肽与靶肽相互作用时，可以固定靶肽的浓度，改变类BRC肽浓度，将二者配制成一系列不同浓度比的混合液，以Tris-HCL(pH值=7.4)缓冲液作参比，两者结合后会导致Tyr及Trp所处的环境发生改变，变得更加裸露或者更加封闭，所以270 nm左右的特征吸收峰强度将发生变化或位移, 据此可以判断它们之间是否发生了相互作用及相互作用的方式，进而可确定其作用机理，并可以测定相互作用的结合常数，同时也可研究时间、温度对相互作用的影响.通常，两条肽之间发生作用后在电子吸收光谱上一定会发生变化，反之则不一定成立[21].周光明[22]利用紫外光谱法研究了阿司匹林与DNA的相互作用，结果表明阿司匹林与DNA相互作用的主要结合模式是嵌入作用.为了确定大黄类有效成分在体内的代谢与转运过程，何梅等[23]利用紫外光谱法研究了中药大黄有效成分与牛血清蛋白的相互作用，结果表明，大黄素、大黄酸、大黄酚与BSA的结合常数分别为K=1.47×105，K=5.00×105，K=1.18×104，与文献报道一致.

4.2 荧光光谱法

荧光光谱法作为一种快速灵敏的光谱方法，也是研究生物分子之间相互作用的主要手段[24].由于蛋白质和多肽中含有带芳环的氨基酸残基，所以可以发生荧光.当类BRC肽与生物大分子结合时，芳环所处的环境发生变化，导致荧光增强或减弱，而分子间的碰撞可以导致荧光猝灭.荧光的猝灭分为动态和静态两种，静态猝灭是由于猝灭剂与荧光物质在基态时生成了不发荧光的复合物而导致的荧光猝灭；动态猝灭是荧光物质分子在激发态时跟猝灭剂分子相碰撞而导致荧光强度的猝灭.如果二者体系是动态猝灭，则根据Stern-Volmer方程[25]：F0/F=1+t0Kq[Q]=1+Ksv[Q]，以F0/F对靶肽浓度作图可得到一拟合直线.由直线的斜率可得到类BRC肽对靶肽体系的荧光猝灭常数Ksv.生物大分子的荧光寿命约为10-8s[26]，可求出类BRC肽对靶肽的荧光猝灭速率常数Kq.若Kq远大于生物大分子之间最大的碰撞常数2×1010L·mol-1·s-1，则类BRC肽对靶肽体系的荧光猝灭为静态猝灭[27-28].马美湖[29]用荧光光谱法研究了核黄素与核黄素结合蛋白的相互作用，利用核黄素对RBP的荧光猝灭效应，测定了两者在不同条件下的结合常数、热力学参数及结合过程中能量转移.结果表明，核黄素对RBP的荧光猝灭机理属于静态猝灭，两者主要靠氢键和范德华力相结合.细胞型朊蛋白是由PRNP基因编码的一种糖蛋白，其错误折叠或者聚集而形成淀粉状纤维致病型朊蛋白，该过程不可逆，而一旦转变，就具有了强抵抗力和异常复制增值的能力.黄承志[30]利用荧光光谱法研究了多肽与朊蛋白的相互作用，结果表明，在合适的酸碱环境下，多肽与蛋白之间可以形成盐桥，所以可以稳定二级结构.

4.3 圆二色光谱法

圆二色光谱(CD)是研究核酸与蛋白质构象常用的一种方法，可以得到生物大分子的二级结构与三级结构.该方法对手性分子的结构十分敏感，可反映出含手性非对称分子内部结构的一些信息，是测定生物大分子构象及其变化的有效方法，因而CD法已成为研究分子构型及分子间相互作用的重要光谱手段之一[31].手性分子都具有光学活性，可使偏振光震动面发生偏转.对于蛋白质和多肽，由于含有L型或D型氨基酸残基，故具有光学活性，在CD谱中产生吸收差值.王洋[32]利用圆二色谱法研究了2,4-二氯苯酚与人血清蛋白的相互作用，结果发现，加入DCP之后，HAS中α螺旋结构的含量减少，肽链有所伸展，表明HAS的构象和所处微环境发生了变化.王群[33]利用圆二色谱法研究了重组内皮抑素与芦荟大黄素的相互作用，结果表明重组内皮抑素与芦荟大黄素作用后，CD光谱中的负峰红移到207 nm，α-螺旋含量下降到2.3%，β-折叠含量增大至64.8%，拐角结构含量下降到1.2%，表明芦荟大黄素结合蛋白后引起其微构象的变化，破坏了一些α-螺旋结构，增加了一些β-折叠结构.张元红等[34]利用圆二色谱法探讨了双阳离子咔唑衍生物与 DNA 的结合方式，发现该化合物先以插入方式与 DNA 结合，当浓度逐渐增大时，以沟槽方式与 DNA 结合.刘静[35]利用圆二色谱法研究了脂肪酸链碳数为15的表面活性素(Surfactin-C15)对牛血清蛋白二级结构的影响，结果表明与传统的表面活性剂相比，脂肪酸链碳数为15的表面活性素对牛血清蛋白影响是温和的.

5 结论

靶肽p53和RAD51是已发现的研究较广泛的基因产物，具有重要的生理功能，其在行使功能的过程中涉及与多种生物大分子的相互作用，需要BRCA2及其产物的调控.根据BRCA2的结构特点，可以利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱及圆二色谱方法研究其与靶肽相互作用的模式、作用机制等.随着科学技术的发展，将涌现更多的技术，可以更好地研究抑癌基因与生物大分子之间的相互作用.

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