噬菌体控制主要食源性致病菌的研究进展

曹振辉，金礼吉，徐永平,*，李淑英，张建城，马永生，李化强，曹 放，杨 扬

(1.大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024；2.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；3.大连理工大学 动物性食品安全保障技术教育部工程研究中心，辽宁 大连 116600；4.大连赛姆生物工程技术公司博士后工作站，辽宁 大连 116600)

噬菌体由Twort于1915年、D’Hérelle于1917年相继发现，是一种可以感染细菌的病毒。裂解性噬菌体(以下简称噬菌体)在感染细菌后，能引起宿主细胞破裂，利用这一特性可以将噬菌体应用于抗菌治疗。在抗生素发现并广泛应用之前，人们就已开始尝试应用噬菌体防治细菌感染，并取得了一系列可喜的成果。自20世纪40年代，由于抗生素实现大规模工业化生产及推广以后，除了前苏联和少数东欧国家，欧美等发达国家噬菌体的抗菌研究曾一度中断。然而，进入20世纪70—80年代，随着细菌耐药性问题和20世纪90年代以来食品安全事件频频发生，特别是超级细菌的出现，应用抗生素进行抗菌治疗面临着巨大挑战，有关将噬菌体作为抗菌制剂的研究又开始受到普遍关注。大量研究显示，噬菌体已经成功地应用于人、家畜、水产养殖动物以及农作物细菌性感染的防治，并在食品保鲜和抗微生物污染方面彰显优势。

在食品生产过程中，抗生素的滥用及过量使用导致了广谱耐药性食源性致病菌大量出现，由其所引起的食源性疾病已成为当今世界上最广泛的公共卫生问题之一。引起食源性疾病的主要病原微生物有沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Campylobacter)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌O157：H7(Escherichia coli O157：H7)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[1]。目前应用噬菌体防治食源性细菌疾病已取得重要进展，本文就噬菌体对上述病原微生物的抗菌作用进行综述，以期为噬菌体及其制剂在保障动物性食品安全领域的深入研究提供参考。

1 噬菌体作为抗菌制剂的优势

与传统的抗生素疗法相比，噬菌体控制食源性疾病致病菌主要有以下优势：1)特异性强。噬菌体具有较强的特异性，特异性可以精确到种、甚至株，只特异性地感染相应的致病菌。通过以致病菌为宿主选择性地筛选其特异性噬菌体，不会干扰人或动物体内正常菌群，不会破坏环境(食品基质)中固有的微生物群落而导致微生态失衡[2]。2)自我增殖性。在适当的条件下，每一个裂解周期内，噬菌体以指数方式增殖，施用剂量得到迅速放大，抗菌有效性增强，在治疗细菌感染中起到至关重要的作用[3]。3)对耐药菌株的再侵染性。某一种噬菌体抗性菌株可以被其他具有类似抗菌谱的噬菌体感染而裂解[4]；另外，某些噬菌体还可以随着抗性菌株的产生而变异，可以重新裂解变异菌株。且通过多种噬菌体混合制成的鸡尾酒制剂，可以避免致病菌对单一噬菌体产生的抗性[5]。4)安全性较高。噬菌体由蛋白质和核酸组成，降解后的终产物是氨基酸和核酸片断，对人或动物来讲不是化学药物等异型物质，噬菌体进入人或动物体内的代谢过程可被视为自然过程[6]；在人或动物体的胃肠道区域[7]以及新鲜的鸡肉、猪肉、牛肉及加工的熟食[8-9]中都发现有噬菌体存在。因此，对于人或动物来讲，噬菌体并非异源物质。5)自然界存在广泛，物种丰富。噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应噬菌体的存在。在人和动物的排泄物、污染的井水、河水以及土壤中，都可分离特异性噬菌体。水和土壤中的噬菌体数量大约是细菌数量的10～100倍，推测噬菌体在地球上的丰度约为1031[10]。6)研发时间短，成本低。筛选新的噬菌体治疗耐噬菌体的细菌感染，时间相对较短，通常可在数天或数周之内完成，而且进化论认为通过自然选择的不断筛选，噬菌体能够治疗耐抗生素和耐噬菌体的细菌感染[4]。

2 噬菌体控制食源性病原微生物

2.1 沙门氏菌

沙门氏菌是一种革兰阴性杆菌，兼性厌氧，具有复杂的抗原结构，一般可分为表面抗原(Vi抗原)、菌体抗原(O抗原)和鞭毛抗原(H抗原)。沙门氏菌病是世界上最为常见的一种食源性疾病，在我国因该致病菌引起的食物中毒居首位。家禽尤其是仔鸡是沙门氏菌人畜共患病原菌的主要寄生场所和传染源[11]。

B o r i e 等[12]研究了混和噬菌体制剂对仔鸡肠炎沙门氏菌的肠道定殖的影响，在接种肠炎沙门氏菌(9.6×105CFU/mL)前24h，以粗喷雾和饮用水的形式施用3株噬菌体(感染复数为103)的混合制剂，结果显示，喷雾形式显著降低了鸡群沙门氏菌感染率，两种使用方式均可显著降低肠道肠炎沙门氏菌的定殖。Atterbury等[13]从养鸡场、屠宰场及废水中分离得到232个噬菌体，宿主谱实验表明其中3株噬菌体对肠炎、Hadar及鼠伤寒沙门氏菌3个血清型具有裂解作用；分别使用上述3种血清型沙门氏菌感染肉用仔鸡，观察噬菌体对不同血清型沙门氏菌定殖的影响，结果表明与对照组相比，24h内第1、2株噬菌体分别降低了盲肠内肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌4.2、2.19(lg(CFU/g))，而较高效价的第3株噬菌体提高了Hadar血清型沙门氏菌的抗性比例，未能影响其定殖。Sklar等[14]以抗萘啶酮酸肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)攻毒仔鸡为研究对象作了类似的研究，揭示除了细菌的噬菌体抗性以外，噬菌体的施用方式、环境以及不同的动物个体等因素可能会影响到噬菌体的抑菌效果。Higgins等[15]考察了噬菌体对鸡胴体肠炎沙门氏菌的抑菌效果，实验中选用人工污染致病菌的肉鸡胴体和自然感染致病菌的火鸡胴体作为实验对象，通过喷洒和浸泡的方式施用噬菌体，结果显示高浓度的单一噬菌体和多种噬菌体的混合制剂均能显著降低胴体的染菌率，同时向肉鸡屠宰场的污水中添加噬菌体可以显著降低污水中的肠炎沙门氏菌浓度；另外，研究人员发现与空白对照组相比，噬菌体Felix 01野生型及其突变型分别显著降低了法兰克福鸡肉香肠中的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)1.8 、2.1(lg(CFU/g))，而两者之间无显著差异[16]。以上研究表明，选择合适的噬菌体和优化噬菌体不同的给予方法、剂量和时间是噬菌体控制沙门氏菌的关键因素。

2.2 弯曲杆菌

弯曲杆菌是世界范围内引起人类急性腹泻的最常见的致病菌。在发达国家，空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和大肠弯曲菌(Campylobacter coli)是引起急性细菌性肠炎的主要病原菌之一。禽类(尤其是鸡)是弯曲杆菌的主要宿主和传染源，食用被弯曲杆菌污染的禽肉是该致病菌的主要传播途径。

Atterbury等[17]从22个鸡场90个鸡群中采集了205个罗斯肉用仔鸡样品，采集盲肠样品检测噬菌体和空肠弯曲杆菌的数量，发现空肠弯曲杆菌及其噬菌体的检出率分别为63%和20%，噬菌体阳性样品中的致病菌的数量5.1(lg(CFU/g))显著低于噬菌体阴性样品6.9(lg(CFU/g))；噬菌体阳性、阴性样品中空肠弯曲杆菌阴性率分别为71%、20%；表明盲肠处的噬菌体与空肠弯曲杆菌的存在呈现负相关性，噬菌体的存在影响了致病菌在盲肠中定殖。Loc Carrillo等[18]研究了2株广谱噬菌体控制鸡感染空肠弯曲杆菌的效果，结果表明分别口服一定浓度的噬菌体可以减少空肠弯曲杆菌在鸡体内定殖的数量，另外，虽然噬菌体疗法可以引发抗性菌株的出现，但这些抗性菌株的定殖能力已有所下降，且能够被噬菌体再感染。Atterbury等[19]在空肠弯曲杆菌NCTC12662 PT14感染鸡皮后30min接种噬菌体Φ2，4℃冷藏，进一步深入研究了特异性噬菌体Φ2对人工感染鸡皮的空肠弯曲杆菌抑菌效果。结果显示，与对照组相比，5×106PFU/cm2的噬菌体接种量在所有的取样点(1、3、5d)均极显著降低了致病菌(接种量为5×105、5×103CFU/cm2)的感染量，同时证实了噬菌体广泛存在于家禽制品中，因此，对于家禽制品，应用噬菌体作为生物抗菌剂，是一种非外源物质的安全制剂[20]。随着我国鸡肉消费量的增长，沙门氏菌、弯曲杆菌食源性疾病的发病率不断增高。综上所述，噬菌体疗法降低鸡饲养过程中沙门氏菌、弯曲杆菌在肠道的定殖，从而可以降低屠宰加工过程中两种致病菌进入人类食物链的风险。

2.3 单核细胞增生李斯特菌

单核细胞增生李斯特菌，简称李斯特菌，是重要的食源性致病菌之一，老人、婴儿、孕妇和免疫能力低下的成年人特别容易受其感染。该致病菌广泛存在于食品原材料和食品加工环境中，由于其能在低温条件下存活，因此该致病菌可以广泛污染冷藏保存的即食食品。

Guenther等[21]研究了噬菌体A511、P100对于即食食品中人工感染Scott A、WSLC1001李斯特菌的抑菌作用，所选用的即食食品包括液体食品(巧克力奶和Mozzarella 干酪)和固体食品(热狗、火鸡切片肉、熏制的三文鱼、海鲜等)。结果显示，人工接种1×103CFU/g李斯特菌后，添加3×108PFU/g的噬菌体，6℃贮藏6d后，液体食品的染菌量迅速降低至直接检测法的检测灵敏度以下， 固体食品的染菌量也得到有效降低，降幅最大可达1×105CFU/g；6℃、13d或20℃、6d的贮藏条件，噬菌体依然表现出相同的抑菌效果；且高剂量的噬菌体(3×108PFU/g)抑菌效果显著高于低剂量(3×107、3×106PFU/g)，证实宽宿主谱的裂解性噬菌体A511、P100均能有效控制即食食品中污染的李斯特菌，且高剂量的噬菌体可通过扩散而非自我复制的方式，增加噬菌体接触到宿主菌的机会。Carlton等[6]对李斯特菌特异性噬菌体P100进行了基因组测序、安全性评价以及其在奶酪中抑菌实验，结果表明，纯化的噬菌体蛋白与李斯特菌及其他产生毒素、致病因子、抗生素耐药基因、过敏源的细菌基因或蛋白无同源性；对连续5d口服P100噬菌体(5×1011PFU/d)的8周龄维斯塔尔鼠进行毒性、药理观察以及病理学检验，结果表明8d屠宰后，实验动物无任何病态或致死性临床表现以及异常的组织学变化，说明P100可作为食品添加剂而无任何潜在危险；在奶酪实际生产中使用含有噬菌体P100的盐水冲洗成熟期的奶酪，使奶酪表面携带噬菌体，实验结果表明重复接种噬菌体(终浓度分别为6×107、2×106PFU/cm2)和1次接种高剂量的噬菌体(终浓度6×108PFU/cm2)，均可以显著降低奶酪(起始浓度2×101CFU/cm2，加工后6℃贮藏5d)中的李斯特菌数量，甚至完全消除该致病菌的污染，且实验过程中无P100噬菌体抗性菌株产生[6]。综上所述，噬菌体的接种剂量及频率均影响噬菌体的抑菌效果，P100噬菌体可作为一种安全、有效的生物制剂控制食品生产及加工设备的李斯特杆菌污染。

2.4 大肠杆菌O157：H7

食源性大肠杆菌O157：H7可通过污染饮水、食品导致疾病暴发流行，引起肠出血性腹泻，病情严重者可危及生命，该病已成为世界性公共卫生问题[22]。牛体及其饲养环境是大肠杆菌O157：H7的主要寄生场所和重要的传染源。如何消除大肠杆菌O157：H7对食品的污染，减少或切断病原菌可能的传播途径，已成为世界范围内亟待解决的问题。

鉴此，大连理工大学噬菌体研究小组与加拿大农业部[23]合作共同检测了4株大肠杆菌O157：H7噬菌体(rV5、wV7、wV8和wV11)的抑菌效果，发现在－2、0、2、6、9d瘤胃插管多次灌喂噬菌体(每剂3.3×1011PFU)，可显著降低牛大肠杆菌O157：H7(0d时瘤胃插管攻毒剂量为1010CFU)的肠道总排泄量；并揭示了天然存在于动物个体和养殖环境中的大肠杆菌噬菌体均能降低大肠杆菌O157：H7在牛群中的检出率。Sheng等[24]报道了2株噬菌体SH1、KH1混合制剂对于定殖于公牛直肠肛门连接处的大肠杆菌O157：H7的影响。实验首先通过直肠给药的方式接种大肠杆菌O157：H7，7d后给予1010PFU噬菌体混合制剂(感染复数≥100)，此外，在噬菌体处理组的饮水中添加噬菌体(106PFU/mL)，结果显示，与对照组相比，实验组直肠肛门连接处的平均病菌浓度显著降低。O’Flynn等[25]报道了噬菌体抑制牛肉表面大肠杆菌O157：H7的效果，结果7/9的牛肉表面大肠杆菌O157：H7检测为阴性，2/9的牛肉表面病菌浓度降至10CFU/mL以下。以上研究表明，使用噬菌体的多株混合制剂可显著降低牛体及牛肉中大肠杆菌O157：H7的数量，从而降低该致病菌的传播几率，并且提示在养殖场的环境中施用噬菌体可降低甚至阻断病原菌在牛群中的传播，从而在牛肉生产的源头上保障食品安全。

2.5 金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是世界范围内又一广泛流行的食源性致病菌，其分泌的细胞内毒素是引起食物中毒的主要原因[26]。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受其污染的机会较多。我国每年发生的此类中毒事件约占细菌性食物中毒事件的25%。

Matsuzaki等[27]研究了宿主谱最宽且不含任何毒素和抗生素抗性基因的噬菌体ФMR11对金黄色葡萄球菌的作用效果，结果显示，当感染复数≥0.1时，该噬菌体能够清除小鼠体内循环系统中的金黄色葡萄球菌(腹腔注射，接种量为8×108CFU)，小鼠的死亡率显著降低。而且体外和体内研究均显示噬菌体可通过致病菌进入巨噬细胞内，有效杀死细胞内的致病菌[28]。Gu等[29]从废水处理系统中分离得到一种金黄色葡萄球菌噬菌体GH15，并分离得到了其内源性裂解酶(LysGH15)，研究该酶对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的抑菌作用。表明LysGH15在体外能够杀死金黄色葡萄球菌，体内能有效控制其感染，可作为一种治疗方法防控耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。García等[30]对2种从牛奶中分离的金黄色葡萄球菌温和噬菌体进行DNA随意切除，获得了2种裂解性噬菌体ФH88、ФA35，研究了这2种噬菌体的混合制剂对金黄色葡萄球菌的抑制作用。结果显示，使用2种噬菌体的混合物在感染复数为100时，可以完全消除37℃条件下超高温全脂乳中的金黄色葡萄球菌(接种量为3×106CFU/mL)，且产生噬菌体抗性菌株的频率是温和噬菌体的1/200；在酸奶的制作过程中，接种1×106CFU/mL 的金黄色葡萄球菌同时添加2种噬菌体的混合制剂，25℃(感染复数为250)和30℃(感染复数为350)的加工条件下，分别在4h后、1h内完全清除了该致病菌。上述研究表明，在动物性食品生产过程中可用金黄色葡萄球菌特异性噬菌体及其裂解酶来消除病原菌污染，提高畜产品品质。

3 噬菌体制剂产品

鉴于噬菌体在控制各种病原菌特别是高耐药性超级细菌方面的显著效果，目前，在全球范围内越来越多的制药公司参与噬菌体的研究及临床实验，对噬菌体疗法广泛关注，并相继有一些噬菌体制剂产品面世。其中噬菌体研究应用于食品领域且具有重要标志意义的事件包括：2006年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准ListShieldTM噬菌体产品可作为食品添加剂，用于即食食品和禽肉制品中控制单核细胞增生李斯特菌污染；2007年，FDA又批准了另外1株李斯特菌噬菌体为公认安全添加剂(GRAS)，可以添加到奶酪等其他食品中；2011年，FDA批准了EcoShieldTM产品可应用于红碎肉中降低大肠杆菌O157：H7污染。可见，随着分子生物学及噬菌体技术的发展，越来越多的噬菌体将会被开发成商品，用于病原菌控制的各个领域。

4 结 语

沙门氏菌、弯曲杆菌、李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等引起食源性疾病的主要病原微生物严重威胁着人类健康，造成了巨大的经济损失。利用裂解性噬菌体的杀菌特性，在从农场到餐桌的全产业链中抑制上述病原菌的传播，已成为食品安全领域的重要研究内容之一。研究表明，在动物性食品生产、加工或贮藏过程中应用噬菌体可以有效地降低或消除病原菌的污染。但噬菌体抗菌的可靠性和安全性仍有待于深入研究和进一步验证，诸如：1)在动物屠宰前，在养殖环境条件下应用噬菌体控制策略的效果不尽一致，因此基于活畜水平的农场控制策略需通过筛选新型高效(裂解能力强和宿主谱宽)噬菌体，并优化施用条件及阐明噬菌体与宿主间的相互作用的动力学原理；2)现有研究结果大多是建立于实验室，通过人工接种致病菌的方法研究噬菌体的作用效果，噬菌体抗菌策略能否在实际生产条件下控制致病菌对动物性食品的污染需要进一步评价和验证；3)在动物屠宰后食品加工环节应用噬菌体控制病原菌的传播，应根据不同食品基质的不同成分、化学特性及加工过程开展具体研究。

总之，噬菌体具有特异性强、自我增殖快、筛选周期短等抗生素无法比拟的优点，具有成为新一代天然、绿色、安全抗菌制剂的可能性。并且，随着生物工程技术的快速发展以及现代生物技术研究手段的不断进步，今后噬菌体控制病原菌的策略和技术会得到完善和突破，并最终替代传统抗生素用于控制食源性致病菌，保障食品安全，保护人类健康。

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