产细菌素乳酸菌筛选方法的研究进展*

侯亚文，易华西，杨艳艳，张兰威，马放

1(哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨，150090)2(哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江哈尔滨，150090)

近年来，利用乳酸菌对食品中一些腐败菌和致病菌的抑制作用来加强食品安全性和延长贮存期的生物保藏法逐渐被食品工业所重视［1］。乳酸菌在代谢过程中可以产生许多抑菌物质，其中细菌素(抗菌肽)是乳酸菌产生的一类分子质量小、无毒、具有抑菌活性的蛋白质或多肽。随着对细菌素作用机制及抗菌潜力的不断挖掘，建立一个产细菌素乳酸菌的快速、高效的高通量筛选平台是目前国内外面临的技术难题。截至目前，细菌素的筛选多数来自发酵食物中的微生物菌群，而我国作为乳酸菌资源十分丰富的国家，为挖掘潜在的、具有我国自主知识产权的新型细菌素及乳酸菌菌株提供了重要渠道。除了nisin和pediocin PA-1之外，对其他乳酸菌细菌素还没有进行很好的大规模生产和开发性研究［2］。由于建立在乳酸菌生物信息学方面的基础研究不断发展，目前大多数快速筛选手段都是基于乳酸菌编码细菌素的基因序列设计特定引物，利用PCR方法实现快速筛选［3］。该方法与传统的琼脂扩散培养法相比，具有特异性强，大大缩短了筛选周期等优点。本文比较综述了目前已经报道的产细菌素乳酸菌的筛选方法，期望为我国乳酸菌细菌素的发掘乃至我国生物防腐剂的开发与应用提供参考。

1 琼脂扩散法

琼脂扩散法是利用待检测菌在琼脂表面对指示菌的生长显示抑制效果的一种定性分析抑菌谱的筛选方法，是Tramer等人1964年建立起来的，适用于不透明、不能使用浊度分析法分析的样品［4］。常用的杯碟法(well test)，滤纸片法(disc diffussion)和点种法(spot inoculation)均属于此类方法。Wolf和Gibbons［5］对琼脂扩散法进行了改进，在培养基中加入吐温20或吐温80加快抗菌肽在琼脂中的扩散，提高了其灵敏度和准确性。目前，国内外大多数产抗菌肽乳酸菌的筛选均建立在该方法的基础上，Nabil Ben利用琼脂扩散法在当地发酵食品中进行产抗菌肽乳酸菌的初筛，从135株乳酸杆菌筛选出31株产抗菌肽的乳酸菌，经鉴定为28株植物乳杆菌和3株发酵乳杆菌［6］。Svetoslav利用琼脂扩散法从一种植物中分离出1株具有抗乳酸菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、李斯特菌诺克(Listeria innocua)、李斯特菌伊万诺夫(Listeria ivanovii)、单核细胞增生李斯特氏菌等致病菌的戊糖片球菌ST44AM，所产生的细菌素经鉴定为片球菌素PA-1，它是一种ClassⅡ型细菌素［7］。胡淑敏利用的牛津杯双层平板法也属于此类筛选方法［8］，他从70株乳酸菌中筛选得到2株具有较高抑菌活性的乳酸菌LAB30和LAB211。黄新凤(2009)等通过抑菌法从生牛奶中筛选出1株对多种G+细菌、G-细菌、酵母菌和丝状真菌的乳酸乳球菌乳酸亚种菌株(Lactococcus lactis subsp.lactis)，并命名为 MB191［9］。

一种乳酸菌可能产生一种或多种细菌素，但由于最佳条件难以控制，很难兼顾细菌生长活力和所产细菌素活力同时保持最佳状态，或者筛选出了高产细菌素而无法发现其潜在的性能更加稳定的细菌素。因而利用琼脂扩散法进行产抗菌肽乳酸菌筛选的同时还应考虑培养基的优化。李秀凉等人利用RSM法优化了副干酪乳杆菌HD17产细菌素的发酵培养基，找到了最大细菌素产生区域进而确定了培养基最佳配方［10］。Amelia等人研究并评价了一些环境因素对植物乳杆菌17.2b产细菌素的影响，发现植物乳杆菌17.2b产细菌素的条件对环境条件十分敏感，与细菌生长并没有关系，细菌素产量达到最大时选择次优增长温度(suboptimal growth temperatures)，pH值选择高于最适生长时的pH值，不需要NaCl［11］。最近的研究表明，一些乳酸菌产细菌素的能力除了与环境因素有关，还与培养基中NaCl浓度和有无表面活性剂有关。Castro等人发现发酵干肠中分离出的乳酸菌在冷藏条件下添加3%的NaCl，以及表面活性剂吐温20和聚氧乙烯脂肪醇醚35，有利于乳酸菌产出热稳定性强的乳酸菌素［12］。

琼脂扩散法具有操作简单、结果直观等优点，同时也具有准确性、重复性差等缺点，很难作为高通量的筛选方法。本课题组将琼脂扩散法作为我们开发的PCR快速筛选方法的辅助验证手段，使结果更加准确可靠。目前虽然陆续有很多快速筛选方法的报道，但是琼脂扩散法仍然是国内外最普遍使用的方法，还没有出现一种筛选方法能完全代替琼脂扩散法。

2 微孔板生物测定法

微孔板生物测定法是Berridge和Barret在1952年提出的另一种基于抑菌活性的半定量筛选方法，基本原理是根据菌体浓度在一定范围内与透光度之间存在线性关系，确定存在线性关系的菌体浓度范围(或透光度范围)，从而建立起菌体浓度(Log10C)和透光度(T%)的线性关系［13］。Bhunia等人采用了96孔板法测定发酵上清液中细菌素的活性，其本质是通过连续的梯度稀释，找到最低抑制浓度或50%抑制浓度，然后以这个浓度作为任意单位，通过稀释倍数来计算原溶液中细菌素的效价［14］。Turcotte等对这种多孔平板法作了改进，对指示菌的浓度和培养时间进行了优化，改变了多孔平板法作为一种半定量方法的局限性。研究表明，96孔板法的检测极限(0.08～60 μg/mL)是琼脂扩散法(0.3 ～10 μg/mL)的 4 ～6倍［15］。

借助于酶标仪，多孔平板法操作起来简便快捷、省时、省力以及精密准确而使其在产细菌素乳酸菌的筛选方面被广泛应用。但是，笔者研究发现由于装有指示菌液的多孔平板必须在培养箱中静置培养12～24 h，多孔平板孔洞中的菌液不可避免会挥发，在平板孔盖上方容易产生水蒸气，一方面改变了孔洞里的原始菌液体积，另一方面影响了比色结果，不能十分精确地测定细菌素的浓度;若稀释倍数产生±1的偏差，会导致估算的原溶液细菌素的效价产生2倍甚至更大的偏差。后来对其进行了改进，一方面在培养箱中垫放湿纱布或湿海绵尽量减少培养过程中菌液的挥发，同时在培养完毕后补加培养液，尽量减少误差。

3 生物荧光法

生物荧光是活的生物组织体内由于代谢活动产生的一种发光现象。将编码荧光素酶的基因克隆到指示菌中，可用于抗菌作用的敏感性检测。利用细菌的荧光素酶基因克隆到金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和沙门氏菌等指示菌中，使得指示菌具有荧光酶基因luxAB和负责合成长链脂肪醛的luxCDE基因，用于产生荧光，不需要外源性醛的加入就可以使荧光稳定产生，无需平板计数和过夜培养就可以快速检测出抗菌作用。该方法已经用于检测乳酸菌的抗菌作用［16］。另外，Norma等人研究了一种基于黄连素流入受损细胞后的荧光放射新型细菌素筛选方法［17］。黄连素是一种位于细胞内的发荧光的生物碱，尽管这种特性的机制还不是很清楚，但它与生物分子包括DNA和葡糖胺多糖相结合时能发出荧光已经得到确认。黄连素分子量小于ATP，可以通过气孔或者细胞质膜破裂后进入细胞［18-19］。鉴于此，由细菌素导致的细胞膜破坏会引起黄连素的细胞内定位，同时使细胞发出荧光。因此，该方法的研究可以用来筛选作用机制为形成膜孔或破坏细胞膜完整性的产细菌素的乳酸菌。

生物荧光法具有快速、准确等优点，可以在1～2 h内得到结果。但这种方法的前提是必须先构建含有荧光酶基因的基因重组指示菌菌株，技术要求较高，虽然从理论上这种方法可作为筛选产细菌素乳酸菌的快速甚至高通量检测方法，但由于指示菌种类(食品腐败菌或致病菌)繁多，实际上不可能一一构建所有的指示菌重组菌株，这种方法不适于用来筛选产广谱细菌素的乳酸菌。

4 基于PCR技术的快速筛选方法

随着在世界范围内对不同乳酸菌菌株基因组测序的完成，基因组序列在挖掘新型高效的细菌素方面扮演着重要的角色，使得利用生物信息学的方法预测和寻找新型细菌素成为可能。根据已知的细菌素DNA序列设计保守的PCR引物或制备寡核苷酸探针，可以在大范围内的乳酸菌群中挖掘出依赖功能性测定时不易发现的细菌素［20］。其中，基于PCR方法的快速筛选可以作为生态学研究中的有效手段，可以鉴定出产细菌素的益生菌，并将其应用在食品工业中。Michat等人基于class IIa型细菌素编码基因，设计了编码class IIa细菌素基因的7对引物，利用PCR方法从40种奶酪样品中筛选出了产class IIa细菌素的乳酸菌［21］。Sunita等人用各种引物的PCR阵列鉴定出了LAB Bac+结构基因，结果表明细菌素PCR阵列可以成功地扩增来自乳酸杆菌、乳球菌以及片球菌中的细菌素结构基因［23］，该研究建立了一种微平板细菌素PCR阵列，可以快速扩增细菌素结构基因。另外，建立在PCR方法上的快速筛选还可以用来分析乳酸菌细菌素的基因簇多样性，而基因簇的多样性或操纵子的多态性可以反映细菌素是否具有广谱抗菌性。Nabil等人利用PCR方法研究了已报道的产细菌素植物乳杆菌，对植物乳杆菌素操纵子的基因图谱进行了研究，用特定引物PCR扩增，将扩增产物用于HindIII，EcoRI和KpnI的限制性群集分析，发现了植物乳杆菌C11中含有若干个植物乳杆菌素基因，而发酵乳杆菌EC11包含了plnDEFG基因簇［24］。我们课题组根据ClassⅡa抗菌肽N-端保守氨基酸序列(-YGNGVCXXXXCXV-和-LDNAIE-)这一特征设计简并引物，建立了基于 Colony-PCR法的产ClassⅡa抗菌肽乳酸菌的快速筛选方法，结合琼脂扩散法，能够快速有效地从复杂的环境中分离出产细菌素的乳酸菌［22］。

基于PCR技术的筛选方法具有灵敏、快速、简单等优点，目前被视为最有可能代替传统琼脂扩散法的方法，但由于所利用的特异性引物均为兼并引物，PCR扩增很难避免非特异性产物，有时甚至出现非特异性产物浓度高于特异性目标产物，虽然我们在研究中对引物和PCR反应条件都进行了优化，但有时仍然会出现扩增产物浓度过低难以回收的情况。究其原因，还是特异性靶点过少或特异性不强，需要进一步增加特异性靶点挖掘的广度和深度。随着乳酸菌代谢产物及其编码基因等生物信息的丰富，利用生物信息学方法从蛋白质水平和基因水平进一步挖掘特异性靶点，有望建立基于PCR技术的产ClassⅡa细菌素乳酸菌的高通量筛选模型，为构建基于我国传统发酵食品宏基因组学的ClassⅡa抗菌肽高通量筛选平台奠定基础。

5 其他方法

在过去的20多年中，许多新方法也被用来筛选产细菌素的乳酸菌，但由于存在的弊端和不足并没有被广泛应用，例如基于多克隆或单克隆抗体的免疫学检测方法ELISA，虽然该方法具有很高的灵敏性，但由于测定的结果与抗菌活力并没有直接相关性，同时抗体与相关物质的交叉反应很难避免，所以依赖于抗体技术的免疫学检测法还有待于抗体的改进和发展。此外，如 ATP生物荧光法 (ATP-bioluminometry)［25］、辐射线法(radiometry)［26］、电导率测定法 (conductancemeasurement)［27］、毛细管区带电泳法 (capillary zonal electrophoresis)［28］、血细胞计数法 (flowcytometry)［29］也有报道。但是这些方法并没有被广泛地应用，其原因主要是因为操作复杂、特异性不强，而且需要专用的仪器和设备。

6 展望

我国是一个乳酸菌资源十分丰富的国家，但对乳酸菌素的研究起步较晚，除nisin外，对其他乳酸菌细菌素还没有进行很好的基础和开发性研究。为了对细菌素活性及分离纯化进一步研究，寻找快速、有效的高通量筛选平台至关重要，同时也成为目前如何获取新型广谱乳酸菌细菌素的瓶颈问题之一。为了避免传统琼脂扩散筛选方法筛选耗时长的缺点，近些年的研究多数建立在生物信息学方法的基础上。由于乳酸菌所产细菌素的分子量比较小，抗菌肽编码基因的cDNA片段较小，通常仅有几百bp，有的甚至只有几十bp，给抗菌肽基因工程操作带来极大困难［30］。另外，抗菌肽基因非常小，实验室一般的质粒检测和PCR检测的方法对于验证表达载体很困难。对于上述难题，最新研究表明可通过基因重组的手段构建杂合子，或者采用诱变育种的手段以期获得新型的广谱细菌素［31-32］。总之，随着对乳酸菌基因组学的不断发展和研究，基于生物信息学的PCR方法将成为快速发掘产细菌素乳酸菌的主要方向和策略，将为开发新型食品天然防腐剂奠定基础。

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