先天性巨结肠与RET基因突变相关性研究

牛会忠 王丽亚 耿建磊

先天性巨结肠(hirschsprung’s disease，HD)亦被称为肠无神经节细胞症，是一种以反复发作并逐渐加重的腹胀、排便困难为临床表现的疾病，是新生儿低位肠梗阻最主要的原因之一，是近年来研究较多的一种常见的消化道发育畸形。其病理常常表现为：肠道末端神经节细胞发育完全缺如，HD的发病率一般认为大约为1/5 000［1］，其中男女发生比例约为4∶1，其中仍以散发型为主，但近年来发现，部分病例有典型的家族病史。家族性HD约占总发病例数中的3.6% ～7.8%［1］，河北省的先天性巨结肠的发病率较高，并有逐年增高趋势，是严重影响我省新生儿及小儿的生活质量的先天性疾病之一。本研究通过分析我院2011年以来收治的40例河北籍巨结肠患儿RET基因外显子DNA的表达变化，并讨论HD与RET基因突变的相关性。

1 资料与方法

1.1 标本来源及基因组DNA提取 选取我院2011年1月至2012年3月收治的HD患儿共40例，所有患儿均系河北籍，其中男31例，女9例;年龄：2 d～4岁，平均年龄1岁3个月。其中散发性34例，家族性6例，所有病例均有典型的临床表现，在术前经过钡灌肠造影、直肠肛管测压法及直肠粘膜乙酰胆碱酯酶组织化学等相关检查确诊，并经过手术病理证实，均明确诊断为HD，所有患儿无合并其他畸形。另外随机选取健康无便秘史相同年龄组河北籍儿童40例作对照组。

所有实验对象均自愿采取静脉血1.5～2 ml，抗凝后通过盐析法提取目标基因组相关DNA片段。

1.2 聚合酶链反应(PCR) 参照相关文献设计所需引物，并由中国科学院微生物研究所基因工程中心合成，序列为F：5'-GACTCGTGCTATTTTTCCTC-3'和 R：5'-TATCTTTCCTAGGCTTCCCA-3';PCR扩增：每25微升的PCR反应体系中应包含DNA模板约 100 ng，10 × buffer 5 μl，1.5 mmol/L MgCl2，0.25 μmol/L引物，dNTP各100μmol/L，Taq酶2 U。反应体系整体经过95℃预变性5 min 后，以94℃ 30 s，56℃ 30 s，70℃ 60 s循环 3次，最后予72℃延伸10 min。所得产物以2%琼脂糖凝胶电泳法检测。

1.3 单链构象多态(SSCP)分析及产物测序 制备8%(49∶1)非变性聚丙稀酰胺凝胶，反应体系中含5%甘油，5μl PCR产物与适量加样缓冲液(90%甲酰胺，0.05%溴酚兰，0.05%二甲苯青)混合，95℃变性5 min后冰浴骤冷，进行凝胶电泳20℃，600 V电泳7 h。电泳结果用银染进行观察。

2 结果

通过对40例HD患儿的RET基因第15外显子的检测结果发现，其中仅3例样本在SSCP电泳中有异常，除正常的两条单链带型和一条未变性完全残留的双链带型外，尚有一条突变带型，考虑突变带型为杂合型突变。重复实验结果相同。3例患儿中1例有明确家族史，考虑为家族性HD。对照组40例RET基因15外显子未见异常。

3 讨论

对于HD发病原理的研究已经有了长足的进展，有国外学者最早通过观察遗传特征明显的家族性先天性巨结肠，对其家系进行了连锁分析，将HD的致病基因初步定位在RET基因。在随后的研究中证实，在部分散发性HD患者中也发现了RET基因的突变。RET基因是近年来作为巨结肠致病基因中被研究的较多和较充分的基因之一，位于10q11.2，共拥有20个外显子，编码了总共包含1 114个氨基酸的跨膜蛋白质，隶属于受体酪氨酸蛋白激酶(RTK)家族，其主要的功能域包括：细胞外配基连接结构和转跨膜区和细胞内催化的酪氨酸激酶结构域，传统研究认为RET基因编码的跨膜蛋白质在神经嵴源性的细胞中均有表达，并担负重要生物学功能，可能负责将细胞外的信息转化为可以在细胞内转导的化学信号［2］。目前国外在RET基因与HD的相关研究较多，但国内在这方面的研究刚刚起步。

HD是一种多基因遗传疾病，近年来随着分子遗传学的发展，有研究表明，在50%的家族性HD和7% ～35%的散发性HD病例［3］中发现了RET基因的突变，而且这些突变均被证实与RET基因功能的降低或缺失有关。我们的研究在此基础上进一步证实了RET基因的突变和表达异常与河北地区先天性巨结肠发病密切相关并具有可遗传性。

随着研究的深入，近几年研究发现，RET基因的突变并不仅发生在编码区，表现为外显子的变异，部分发生在RET基因内含子部分或邻近区域的调节序列上，通过调节或干扰RET基因的表达发挥作用，包括缺失、插入、框移、同义、错义、拼接突变。各个编码区不同的突变可以导致合成的酪氨酸激酶各功能域产生相应变异，影响其相应的功能，从而导致HD的发病。且RET基因的改变只能解释一小部分HD的发病机制，尚不全面。而占相当大比例的非综合征型、散发性HD患儿中，检测到目前已知相关基因的编码序列突变是很难的［4］。目前已有许多关于HD基因突变的报道，仅由某一基因的突变率尚不能解释全部HD患者病因，尤其是对于散发性病例，更是难以解释。故可以推测其他基因和(或)环境因素多因素均影响HD的发生：现有的证据表明大多数HD为多基因遗传如RET、GDNF、EDNRB、EDN-3、SOX10 等相关疾病［5］。国内还有散发性HD患者主要以EDNRB基因突变为主的相关报道［6］。还有研究表明SOX10对RET基因的转录具有调节作用，并可以影响RET基因与EDNRB基因的相互作用［7］。所以单一的基因研究有很大的局限性，其中环境因素在多基因疾病发展过程的作用也是不能忽视。

本试验组中40例患儿也仅3例可见异常泳动带型。我们认为在以下几个方面可能是导致突变检出率较低的原因：(1)RET基因共拥有20个外显子，而我们未能全部检测，仅仅针对突变率最高的一个外显子进行了相关检测，可能应该是导致突变率检出较低的主要原因。在今后的实验中通过针对更大样本检测更多的外显子有可能明显提高相关基因突变率的检出率;(2)RET基因非编码区的突变可能对RET基因表达产生调节性作用，从而在HD发生中起重要作用。本研究未能检测非编码区的DNA序列，在一定程度上影响了突变检出率;(3)HD是一种多基因遗传病，突变不仅仅发生在RET基因中，其他基因位点如EDNRB、SOX10、EDN等的突变或受到某些因素影响，相应的修饰位点产生调节性改变都有可能导致HD的发病，而这些变化不导致RET基因本身的变异，不能被我们的实验检出，降低了检出率;(4)近年来，我省HD发病率有升高趋势，提示地域性因素和周围环境因素有可能通过影响一个或多个基因的表达，在HD这种多基因疾病的发病中起一定作用，

一般认为，HD是一种由多个基因共同影响而导致的的先天性疾病，并不是所有的HD病例都可以通过某一个单一的基因突变来解释;近年来，虽然分子生物学等现代化手段有了长足的发展，但目前人们对于HD的发病机制的研究仍处于初步阶段，仍很不全面。距离全面理解HD的发病机制还有很多工作需要进行，仍需我们进行更深入更全面的研究。

1 Puri P.Hirschsprung’s disease.In：Oldham TO，Colombani PM，Foglia RP，eds.Surgery of infants and Children.Scientific Principles and Practice.New York：Lippincott-Raven，1997.1277-1299.

2 Bordeaux MC，Foreet C，Granger L，et al.The RET proto-oncogene induces apoptosis：a novel mechanism for Hirschsprung’s disease.EMBOJ，2000，19：4056-4053.

3 Attie T，Pelet A，Edery P，et al.Diversity of RET proto-oncogene mutations in familial and sporadic Hirschsprung disease.Hum Mol Genet，1995，4：1381-1386.

4 刘翠平，李继承.RET原癌基因与先天性巨结肠相关性的分子遗传学研究进展.细胞生物学杂志，2008，30：15-18.

5 Brooks AS，Oostra BA，Hofstra RM.Studying the genetics of Hirschsprung’s disease：unraveling an oligogenic disorder.Clin Genet，2005，67：6-14.

6 魏明发，王果，朱珉，等.先天性巨结肠症RET和EDNRB基因的突变.世界华人消化杂志，2004，12：635-638.

7 Owens SE，Broman KW，Wiltshire T，et al.Genome-wide linkage identifies novelmodifier loci of aganglionosis in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.Hum Mol Genet，2005，14：1549-1558.