去势雌性大鼠骨质疏松模型的研究

2013-04-08王键龚颜曾荣魏劲松

海南医学 2013年3期

关键词：去势骨量动物模型

王键，龚颜，曾荣，魏劲松

（广东医学院附属医院骨外科，广东湛江524001）

·综述·

去势雌性大鼠骨质疏松模型的研究

王键，龚颜，曾荣，魏劲松

（广东医学院附属医院骨外科，广东湛江524001）

骨质疏松(Osteoporosis)主要表现为骨量减少和骨组织微结构退行性改变等特征，以致骨脆性、骨折危险性增加的代谢性全身骨骼疾病。合适的骨质疏松动物模型是研究骨质疏松症的重要基础。本文就绝经后骨质疏松雌性大鼠模型复制的基本方法、月龄和造模的选择及常用的评价指标特点简要综述，为研究去势骨质疏松疾病动物的正确选择提供参考。

绝经后骨质疏松；大鼠；动物模型

骨质疏松（Osteoporosis，OP）是多病因引起的，以骨量减少和骨组织微结构退行性改变为特征，以致骨脆性、骨折危险性增加的代谢性全身骨骼疾病。OP按病因可分为原发性、继发性和特发性三类，其中，Ⅰ型原发性骨质疏松即绝经后骨质疏松症，发生于绝经后女性人群中，其主要病理机制与破骨细胞骨吸收功能活跃为主因的骨重建失去平衡有关。在研究绝经后骨质疏松症相关的药理、机制等过程中，诸如小鼠、大鼠、兔、狗、猪、羊等[1]动物模型都有被采用。实验动物合理的选择要求符合方便性、相关性和适宜性三大原则，且具有可重复性的稳定性，尽量使OP在组织病理学上与人类表现一致。而大鼠去势后骨矿含量下降、骨吸收迅速增加[2]、骨骼强度下降[3]等表现均与人类有众多的相似之处，相对其他动物模型来说，具有繁殖快、花费低、易于饲养和管理、遗传背景明确等优点，已被作为最常用的动物模型，现广泛运用于评价和开发绝经后骨质疏松治疗新药等研究[4]。本文就近几年骨质疏松研究中雌性大鼠去势模型的研究综述如下：

1 大鼠种类的选择

实验用大鼠分远交和近交系，其中远交系有Spraque-Dauley、Wistar、Holtzman、Long-Evans等，近交系包括Fischer344、ACI、Brown-Norway、Wistar-Furth、Lewis等品种。目前最常用的是Wistar大鼠和Spraque-Dauley大鼠（SD大鼠）。

2 模型制备方法

目前国内外研究大多使用经典的手术切除双侧卵巢造模，该模型很好地模拟出人体雌激素下降造成的破骨细胞活动加速、成骨细胞功能代偿性增强的高转换型骨代谢等特点[5]，而且处理因素单一，成模效果肯定，实验结果可靠性好，可较快地复制出OP模型。但临床OP患者在绝经后卵巢间质细胞仍有一定程度的内分泌功能[6]；其次，与人类骨骼相比，大鼠皮质骨缺乏Haversian系统及皮质内改建[7]，不适于用作研究临床上卵巢切除术对皮质骨影响的模型；最后，手术造模是一项创伤性操作，难免会引起机体应激反应、电解质紊乱等[8]。以上的模型缺点都可能会对实验的结果产生一定影响，限制了该模型完全模拟临床OP的应用。

不摘除卵巢而是给予药物，会造成体内雌激素的含量减少，经过一定时间后，也可以造成动物的骨丢失。可用的药物有促黄体激素释放激素激动剂[1，9](Luteinizing hormone-releasing hormone agonist，LHRHAs)、促性腺激素释放激素激动剂[10](GnRH agonist)以及非甾体类雄激素拮抗剂[1，5]等，均可使体内雌二醇减少，达到药物模拟去势的效果。给药法虽然不产生动物应激反应、电解质紊乱等问题，但是这种方法可能涉及两种或更多激素之间的作用，并且药物副作用不可避免，这些可能会与研究处理因素产生相互影响，成模效果不确定，人为地增大实验复杂性，因此降低实验结果可信度，实际应用有限。

3 造模大鼠月龄和成模时间的选择

一般而言，大鼠2个月龄时性成熟，17～18个月龄后进入老年期，平均寿命3年。合适月龄的大鼠对于OP的实验研究十分关键。

对正常非手术未孕产的雌性大鼠，王晓等[5]比较后认为，3～6个月龄骨生长活跃；6、7个月龄骨骺出现封闭，骨代谢相对稳定；10个月龄后出现峰值骨量；而骨生物力学效能达峰值12个月龄时才出现；12～16个月龄则更多地表现为骨量的快速丢失。因此针对不同月龄的特点，可以通过对3～6个月龄大鼠施加不同的因素，研究骨量形成的影响；在骨代谢相对稳定的6、7个月龄大鼠，不仅可施加手术去势、药物干预、悬吊固定等处理来观察实验因素对骨质平衡的影响，也可以长期药物喂养，研究药理对OP的预防作用；12个月龄之后的大鼠由于主要表现在骨量的丢失，因此适合用于老年人骨量峰值过后骨质丢失治疗的应用实验。由于去势后的长期雌激素缺乏，16～24个月龄的大鼠乳腺肿瘤的发病率上升[11]，已不适用于骨代谢治疗的研究。

目前大多学者采用3～9个月龄的大鼠进行实验。有学者对不同月龄大鼠卵巢切除术后观察比较指出[12-14]，3个月龄大鼠骨骼还处于生长期，在术后2个月内骨矿含量仍有增加，6～8个月龄鼠大鼠骨峰形成相对稳定，性激素减少导致骨质的变化更符合绝经后女性的变化规律，而12个月龄的SD大鼠由于骨密度与骨钙含量的变化较小，因此适宜用于复制老年性的骨质疏松。

由于成年大鼠的骨重建周期为30～40 d[15]，理论上去势处理后1～2个月内即可进行药物干预。刘晓青等[16]通过去势后4周、12周和18周的观察，发现去卵巢前4周时间内骨量降低最快，随后速度减慢。考虑到即使在去卵巢后，大鼠的骨形成和骨吸收的变化也受到其月龄增长的影响，因此术后1个月较适宜运用于药物治疗的实验处理。

已产仔的雌性大鼠，因动物在孕期和哺乳过程中，体内对钙需求高于正常，多有可能出现骨骼生长缓慢，以及影响实验中血钙等数值的测量。因此在一般的OP治疗的研究中，应尽量选用未孕产的雌性大鼠，避免上述因素的干扰。

综上所述，不同种族的大鼠虽然生活习性和生长曲线不尽相同，但都可以成功的制作出模拟绝经后骨质疏松的模型。考虑到去势后饲养和药物治疗的时间对大鼠的月龄也会造成影响，选择6个月龄大鼠去除卵巢后1个月比较适用于药物治疗OP的实验研究。此时大鼠术后的骨量丢失明显，骨吸收活跃，耦联骨形成增加明显，形成高转换型的骨质疏松特点，较符合绝经后骨质疏松的特点，制模时间较短，成模效果肯定，可以较好地节省实验时间和经费。

4 大鼠模型较常用的部分评价和判断指标

4.1 反映卵巢切除的指标卵巢是否成功切除干净，不仅要将切除物组织镜检，还要通过术后连续两周的每天阴道分泌物涂片镜，观察子宫内膜组织学变化，一般来说，大鼠性周期为96～120 h，可以在术后较快地明确双侧卵巢切除是否彻底。也可在处死大鼠后行子宫质量称重和子宫系数的比较，进一步从功能上说明卵巢切除成功，雌激素减退。子宫系数=子宫质量/体质量[17]。血液的改变主要表现在雌二醇的变化，可以通过测定血清雌二醇来证明达到绝经后的标准。

4.2 骨量变化的常用指标按照中国人原发性骨质疏松症诊断标准，要求骨量丢失大于均值的25%才可诊断为OP，因此骨密度的测量为必须反映骨质疏松造模成功与否的指标，该标准目前主要以DXA (双能X线吸收法)为手段制定，辅以多种方法的应用。因此，骨矿含量(Bone mineral content，BMC)、骨密度(Bone mineral density，BMD)等常成为人们造模的必选指标之一。这些指标除了运用DXA骨密度仪，也可选用采用单光子(SPA)、双光子吸收法(DPA)和定量CT(pQCT)等技术，评估体内BMC和BMD。采用影像学方法最大的优点是无损伤性。其中SPA较简便价廉，不能检测中轴骨[18]，通常用于桡骨（非优势臂）、跟骨、掌骨或指骨测定；而DXA分辨好，可以排除软组织的干扰，提高了灵敏度与精确度；有条件也可运用CT三维重建技术对骨密度做更直观的观察。但由于体内各部位的骨量丢失不尽一致[19]，在多部位检测骨密度时应注意造模时间对不同部位出现骨质流失的影响。除了影像学方法，也可通过标本骨组织直接取材，进行脱钙骨组织病理学检查，该方法可以从组织学的角度发现骨质的受损。也可行荧光标记后，染色切片观察，其中较为常用的反映骨组织形态计量学静态参数有代表骨量的骨小梁面积百分数(%Tb.Ar)、反映骨结构参数的骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)等；反映骨转换的动态指标包括反映骨形成活力的荧光标记周长百分数（L.Pm%）、骨矿化沉积率(MAR)、单位长度骨小梁表面上骨形成率(BFRPBS)、单位骨小梁面积骨形成率(BFRPBV)以及反映骨吸收活跃程度的单位骨小梁面积上破骨细胞数量(Oc1N)、单位骨小梁面积上破骨细胞周长百分数(%Oc1Pm)[16]。有条件运用扫描电镜更能发现骨小梁密集程度、小梁间距、胶原数量、皮质区钙盐沉积、钙盐颗粒密集度等的变化[17]。而且病理切片快捷、经济，测量结果与DEXA数据有高度相关性，与骨生物力学功能改变吻合良好，在骨质疏松模型及药效评价中具有一定的应用价值[5]。

4.3 骨代谢的常用生化指标除了较常用的血钙尿钙、血磷尿磷和尿肌酐外，还包括成骨功能的指标和反映骨吸收功能的指标。骨形成标志物有：血清骨碱性磷酸酶(ALP)、骨碱性磷酸酶（BAP）、血清骨钙素(BGP)、血清I型前胶原氨基末端肽N-端(PINP)、血清I型前胶原氨基末端肽C-端(PICP)等。骨吸收生化标志物有：血抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）、Ⅰ型胶原羧基交联肽C-端(CTX-Ⅰ)、尿脱氧吡啶啉(DPD)、血清I型胶原交联氨基末端肽N-端(NTX)、羟脯氨酸(Hyp)等。其中，BGP是由成骨细胞合成和分泌入血的，血清中的OC水平与骨组织中的水平呈正相关，可直接反映成骨细胞的活性和骨生理代谢变化[20]。而CTX在骨质疏松治疗前后变化率较大，而长期个体内变异又较小，稳定而又灵敏，可以作为评判治疗效果的首选指标[5]。由于骨转换生化指标的变化较病理变化早，一般在术后1～2.5个月就有明显变化，因此骨转换生化指标可以作为反映绝经后早期骨量丢失的灵敏指标[21]，有助于造模的预测性诊断。

4.4 骨生物力学的常用指标常用的骨生物力学指标的检测包括常规的骨长度、直径和厚度等，还有骨弹性极限载荷、断裂载荷和刚度等指标[22]。而长骨干中段三点弯曲力学试验也越来越多地被运用，该试验反映骨结构力学指标主要有最大载荷、最大桡度、扭力矩、弹性载荷、弹性桡度及能量吸收等。这些检测反映骨生物力学强度的变化，可以辅助评价发生骨质疏松性骨折的风险。

5 小结

建立骨质疏松动物模型在研究骨质疏松的发病机制、探讨防治措施和新药研究中均占有十分重要的地位，而去势雌性大鼠动物模型作为绝经后骨质疏松动物实验经典的研究材料，已被大多数学者所接受并广泛运用。本文就近年去势雌性大鼠的制模方法、月龄选择及检测指标作一综述。值得关注的是我们对理想模型的要求是它的病变过程、病理改变及演变转归尽可能与人类骨质疏松症的变化相似，但不可否认大鼠承载应力与人类不同，骨骼生长状况也因此与人类不尽相同。并且受体型的限制，血量少，不能多次取骨活检标本和大量采血标本，而且药代动力学也与人类不同。受上述各种限制，大鼠去势模型只可作为药物效果的初步研究和OP的病理机制的初步探索，如果要做进一步药物疗效的研究和模拟人类OP的探索，还需在其他种类的动物模型上探讨。

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