绿茶提取物EGCG对实验性口腔鳞癌移植瘤淋巴管形成的影响

陈秀兰

(咸宁市中心医院口腔科，湖北咸宁437100)

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤，其恶性度高、侵袭性强，易发生淋巴结转移。研究表明，约50%的患者在诊断为口腔鳞癌时已经发生了淋巴结转移［1］。口腔鳞癌的淋巴结转移直接影响临床治疗方式和颈部淋巴结清扫的范围，是导致其预后差，5年生存率低的主要原因。研究证实:肿瘤转移的过程不仅仅是原有淋巴结被动接受瘤细胞浸润的过程［2］，还包括肿瘤和区域性淋巴结尤其是前哨淋巴结周围新生淋巴管形成的过程［3］。血管内皮生长因子－C(vascular endothelial growth factor－C，VEGF－C)在新生淋巴管形成方面起了主要作用。本实验的目的就是研究绿茶提取物茶多酚中的主要活性物质表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin－3－gallate，EGCG)对实验性口腔鳞癌移植瘤表达VEGF－C的影响，探讨EGCG靶向抑制口腔鳞癌淋巴管形成的可行性及相关机制，期望为今后新药开发、临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取24只5周龄的BALB/c裸鼠，雌雄对半。细胞株:人舌癌细胞株Tca8113购于湘雅医学院细胞库。

1.2 主要试剂及配制方法

EGCG用RPMI 1640培养液配制成0.1%的母液，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后于4℃避光保存，使用前按设定浓度用RPMI 1640培养基稀释后使用。RPMI 1640培养液购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司。兔抗人VEGF－C多克隆抗体(LOP－1516)购自上海工硕生物技术有限公司，鼠抗人D2－40单克隆抗体(DM－004)购自上海亿欣生物科技有限公司。SP免疫组化试剂盒购自福州迈新生物有限公司。

1.3 细胞培养

人舌癌细胞株Tca8113用含有10%胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的 RPMI 1640培养液，在37℃，含5%CO2的饱和湿度的培养箱内培养，2～3d换液传代。

1.4 实验分组

选取24只5周龄的BALB/c裸鼠，皮下注射口腔鳞癌细胞株7d后，随机分成3组，分别喂食含有0(1组)、0.01%(2组)、0.1%(3组)EGCG的自来水35d。

1.5 石蜡组织切片的制备

实验结束后，采用颈椎脱臼法处死裸鼠。小心剥离移植瘤，置于10%中性多聚甲醛溶液中固定24h，梯度酒精脱水、二甲苯透明后，石蜡包埋。经组织切片机切片、摊片、捞片、烤片后制成厚度为5μm的组织切片备用。同一蜡块采取连续切片，一部分用于检测VEGF－C的表达，另一部分用于检测微淋巴管密度。

1.6 免疫组化法检测VEGF－C的表达

采用免疫组化SP法，按试剂盒说明书进行染色，以PBS代替一抗作为空白对照。即切片脱蜡至水后，经内源性过氧化物酶灭活、抗原修复、血清封闭、兔抗人VEGF－C多克隆抗体(一抗)4℃过夜，辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)37℃ 30min孵育后，滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉素卵白素工作液，DAB/H2O2反应染色。苏木素复染、常规脱水、透明、干燥、封片。每组内每张切片随机挑选至少6个观测区，用400倍视野进行拍照(尽量让组织充满整个视野)。应用Image－Pro Plus 6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片的阳性细胞累积光密度值(integrated optical density，IOD)。每组照片的平均值代表该组的IOD值。

1.7 免疫组化法检测微淋巴管密度(lymphatic micovessel density，LMVD)

方法同上，只是一抗为鼠抗人D2－40单克隆抗体，二抗为HRP标记的兔抗鼠IgG抗体。D2－40标记微淋巴管密度(LMVD)判定［4］方法:在低倍镜下(×100)选取脉管数目最多的两个区域，即“热点”(hot spots)，然后在高倍镜下(×400)观察每个热点中的5个视野，计数其中脉管数，但应忽略管腔直径＞8个红细胞或管壁有平滑肌存在的脉管，最后计算2个热点、5个视野的平均脉管数。

1.8 统计分析

应用SPSS 12.0软件对数据进行统计分析。实验数据以均数±标准差表示，组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 VEGF－C 的表达

VEGF－C的阳性染色为棕黄色，表达在移植瘤癌细胞的胞浆内，为局灶性或弥散性分布。1、2、3组的 IOD分别为:7983.16±1024.41、5372±879.63、2461.43±794.62。组间均数的比较显示差异具有显著性。

2.2 LMVD计数

D2－40特异性地表达在淋巴管内皮细胞，呈棕黄色颗粒。血管内皮细胞和肿瘤细胞中未见表达。1、2、3组的 LMVD计数分别为:12.64±2.73、8.13±2.01、5.37 ±1.16。组间均数的比较显示差异具有显著性。

3 讨论

VEGF－C是VEGF家族新成员，主要介导淋巴管内皮细胞的增殖和趋化。已有研究证实VEGFC/VEGFR－3在口腔鳞癌中存在异常表达，其表达水平与微淋巴管密度明确相关［5］。EGCG是绿茶提取物茶多酚中的主要活性物质，MTT、吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色、DNA琼脂糖凝胶电泳等实验表明EGCG对口腔鳞癌细胞株Tca8113有明显的抑制增殖、诱导凋亡作用，并存在浓度、时间依赖性［6］，但机制尚不明确。本实验通过免疫组化法研究EGCG对实验性口腔鳞癌移植瘤VEGF－C表达的影响和对微淋巴管密度的影响，结果表明:EGCG能明显抑制移植瘤中VEGF－C的表达，显著减少微淋巴管的密度，并存在浓度依赖性。提示EGCG通过特异性地下调VEGF－C的表达，阻断新生淋巴管的形成，从而降低淋巴结转移率，提高5年生存率。这一结论虽不能提示饮用绿茶可以直接治疗舌癌(饮用所摄入的剂量不足以达到实验中提示的有效量)，但是仍揭示了EGCG作为潜在的肿瘤实验性治疗药物的应用价值。

［1］O＇Donneil RK，Kupferman M，Wei SJ，et a1.Gene expression signature predicts lymphatic metastasis in squamous cell carcinoma of the oral cavity［J］.Oncogene，2005，24(7):1244

［2］Baner ji S，Ni J，Wang SX，et a1.LYVE－1，a new homologue of the CD44 glucoprotein，is a lymph－specific receptor for hyaluronan［J］.Cell Biol，1999，144(2):789

［3］Skobe M，Hawighomt T，Jackson DG，et a1.Induction of tumor lymphangiogenosis by VEGF－C promotes breast caricer metastasis［J］.Nat Med，2001，7(2):192

［4］Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al.Tumor Angiogenesis:answer ignificant and independent prognostic in dicator in early stage breast carcinoma ［J］.J Nati Cancer Inst，1992，84(24):1875

［5］Chen SX，Li XY，Kong XL，et al.The expression of vascular endothelial growth factor－C in oral squamous cell carcinoma and its associations with angiogenesis，lymphangiogenesis and lymph node metastasis［J］.Hua Xi Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2010，28(3):319

［6］王辉，朱姚琪，刘琴姚，等.绿茶提取物EGCG对舌癌Tca8113细胞凋亡的影响［J］.现代中西医结合杂志，2011，20(21):2621