不同益生菌体外模拟胃肠道环境耐受性的比较研究

2013-04-08张媛媛阳艳林黄广明

饲料工业 2013年17期

■张媛媛阳艳林黄广明劳晔

（建明工业（珠海）有限公司，广东珠海 519040）

益生菌（probiotics）即对人和动物有益的细菌。人们常把应用于畜牧业生产上的益生菌称为微生物饲料添加剂[1]。2001年，FAO/WHO（联合国粮农组织/世界卫生组织）将益生菌定义为“摄入量足够时对机体产生有益作用的活性微生物”[2]。随着科学技术的发展，人们对益生菌的研究更加深入，益生菌的定义也在不断的变化与完善中。2006年，意大利学者M.Del Piano和L.Morelli等认为益生菌应该定义为“在一定程度上能耐受胃液，胆汁和胰脏分泌物而黏附于肠道上皮细胞，并在空肠和回肠大量繁殖的一类活的微生物”[3]。这一定义在一定程度上，更符合益生菌制剂在对人和动物发生益生作用时所经历的生物过程。益生菌制剂在被人或动物食用后，只有在大量活菌顺利抵达、黏附并成功定植于回肠和结肠部位时，才能对宿主发挥益生作用[4]。在这一消化过程中，胃部的低pH值环境及胃液中胃蛋白酶等抗菌物质就成为阻碍益生菌进入肠道的第一道天然屏障。因此，菌体细胞对胃肠道环境具有较高的耐受性成为筛选优良益生菌菌株的关键标准之一[5-6]。

本试验对市售5种微生物饲料添加剂的胃肠道环境耐受性做了比较研究，以期为该类产品的使用提供依据，帮助消费者更好的识别优质的益生菌产品。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

克洛生TM是一种芽孢杆菌类微生物饲料添加剂，主要成分为枯草芽孢杆菌PB6菌株，由建明工业（珠海）有限公司提供。另4种来自不同公司生产的市售微生物饲料添加剂A、B、C、D，由建明工业（珠海）有限公司在市场上收集提供。产品A、B属于芽孢杆菌类制剂，产品C、D属于乳酸菌类屎肠球菌制剂，其中产品D为经包被处理的乳酸菌，详情见表1。

1.1.2 培养基及主要试剂

菌落计数培养基（PCA），PBS缓冲液、胃蛋白酶、胰蛋白酶、猪胆盐、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠等。

1.1.3 主要器材

立式压力蒸汽灭菌锅LS-B50L-Ⅲ型（购自江阴滨江医疗设备有限公司）、气浴恒温振荡器THZ-82(购自江苏金坛市佳美仪器有限公司)、生化培养箱SPX-100B-Z型（购自上海博讯实业有限公司）、ESCO二级生物安全柜（购自北京五洲东方科技发展有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 人工胃液制备

取稀盐酸16.4 ml，加去离子水800 ml,充分搅拌后，调节pH值至2.5,去离子水定容至1 L，121℃高压灭菌15 min后，冷却至室温，加入胃蛋白酶10 g，混合使其充分溶解。

1.2.2 人工肠液制备

取磷酸二氢钾6.8 g，加去离子水500 ml，充分搅拌溶解，用0.1 mol/l氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，去离子水定容至1 L 121℃高压灭菌15 min后，冷却至室温，加入胰蛋白酶10 g，猪胆盐3 g（0.3%），混合使其充分溶解。

1.2.3 体外模拟胃肠道消化试验

精密称取1.000 g样品，无菌操作下，置于150 ml锥形瓶中，加入20 ml人工胃液，同时将瓶子放入恒温振荡摇床37℃、90 r/min培养1 h。然后加入80 ml人工肠液，37 ℃，120 r/min继续培养2 h。吸取1 ml培养后的菌悬液于9 ml PBS缓冲液中作系列稀释（此为10-3稀释度），根据样品大致活菌数含量，稀释到合适的浓度梯度，最后采用平板菌落计数法进行活菌计数。

1.2.4 活菌计数及耐受率计算

采用平板菌落计数法[7]。

胃肠道耐受率(%)=胃肠模拟耐受之后的活菌总数/未经耐受的活菌总数×100。

2 结果与分析

由表1可知，5种微生物饲料添加剂产品的胃肠道环境耐受性存在很大差异，克洛生的耐受率相对较好，达到55.1%；产品B和D的耐受率相近，分别为32.8%和42%。产品C的耐受率为1.12%，对胃肠道环境的抵抗力较差，而产品A经胃肠耐受试验后，耐受率接近0，即无法抵抗胃酸环境和肠道内的高胆盐渗透压作用，菌株大部分失活，不能发挥益生作用。

由于芽孢具有较强的抗逆性，芽孢杆菌在营养条件不充足或经受不良环境作用时，会产生芽孢帮助其存活，而乳酸菌的抗逆性相对较弱，在逆境下更容易失活。因此，多数芽孢杆菌类制剂的胃肠道环境耐受性要高于乳酸菌类制剂。试验结果证明，乳酸菌类产品C未经任何包被，耐受性很差，而同属于乳酸菌类的产品D，由于进行了包被技术处理，对菌体起到了保护作用，其耐受性相对较好。克洛生、产品A、产品B同属于芽孢杆菌类制剂，但这3种产品的耐受性之间仍然存在很大的差异，且益生菌制剂所含活菌数越高，其益生效果并不一定越好。由此可见，不同益生菌菌种间生物特性差异很大，即使属于同一菌种的不同菌株间，各项生物性能依然差异显著。

3 讨论

目前我国微生物饲料添加剂的法规并不健全，进行质量评定时，只有参照《微生物饲料添加剂技术通则》，除此之外，并无其他关于微生物饲料添加剂的统一质量标准[8]。如今的微生物饲料添加剂市场上，产品种类五花八门，质量性能参差不齐，优劣产品鱼龙混杂，面对眼花缭乱的益生菌产品更是无法辨别其优劣。因此，消费者在选取益生菌产品时，除了关注益生菌的抑菌效果和抑菌谱以外，也应该关注以下几方面：①产品菌种、作用和主要用途标示明确，活菌数标示量与实际值要相符，杂菌污染低，产品稳定性好。②有些益生菌产品要混入动物饲料中进行制粒处理，这一类产品要注意对高温高压的耐受性如何，是否能抵抗高温制粒的加工工艺，避免失活。③无论如何，益生菌最终必然要通过人或动物的消化系统进入肠道内发挥作用，因此，对胃酸和胃蛋白酶的耐受能力、抵抗胆汁酸盐高渗透压的能力等成为决定优质益生菌最关键的性能之一。④除此之外，还要根据实际面临的问题，重点关注益生菌产品的产消化酶能力、产酸能力以及与抗生素的兼容性等方面，最终选取最能满足自身需求的产品。

本试验仅对市售5种微生物饲料添加剂产品的胃肠道环境耐受性进行了比较。研究发现，芽孢杆菌类制剂的胃肠道耐受性普遍高于乳酸菌类制剂。即使同属于芽孢杆菌制剂，不同菌株间的耐受性也存在很大的差异。例如产品A与B同属于芽孢杆菌类制剂，而产品A的胃肠道耐受性却最差。因此，选择益生菌产品时，一定要充分了解其综合性能，单纯一项指标较高，仍然无法保证其发挥益生作用以致最终达不到预期的效果。盲目选择益生菌产品不但起不到益生作用，还会带来不必要的经济损失，只有根据实际情况，科学合理的选用微生物饲料添加剂，让其充分发挥绿色微生态制剂的作用，才能带来更大的经济效益。