肌酐产物对肾小管上皮细胞增殖的抑制作用

胡白瑛

(柳州市柳铁中心医院，广西柳州545007)

肾小球硬化和肾间质纤维化一直被认为是慢性肾功能不全进行性恶化的主要病理基础。近年来，研究发现肾小管损伤也是加剧肾功能不全的主要因素。但是，在肾功能不全的环境中，肾小管上皮细胞的生长受到了怎样的影响及其机制尚不清楚。2005年1～5月，我们以肌酐代谢产物作用于肾小管上皮细胞，观察肌酐代谢产物是否具有抑制肾小管上皮细胞生长的作用。

1 材料与方法

1．1 材料 胚胎肾原代培养的人肾小管上皮细胞;肺炎克雷伯氏菌;肌酐;无蛋白培养基:基础培养液为DME和F12(1∶1)的混合培养液，添加胰岛素2．5μg/mL、氢化可的松18 ng/mL、促表皮生长因子5μg/mL等;完全培养基:在无蛋白培养基中加入8% ～10%的胎牛血清。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养及分组 将含0．14 mg/mL肌酐的无蛋白培养液1 mL放于Eppendoff管中，每管中加入1菌环肺炎克雷伯氏菌，放入37℃恒温箱培养48 h，离心取上清液，矫正pH后过滤除菌，作为肌酐产物备用。将已传代的肾小管上皮细胞用0．25%的胰酶消化、计数，按每孔5 000个细胞分别植入96孔细胞培养板内，培养48 h，细胞贴壁生长后，更换无血清培养基同步24 h。每6孔为1组。对照组:含10%胎牛血清的完全培养基;肌酐组:含肌酐0．14 mg/mL的完全培养基;肌酐产物组:含肌酐产物的完全培养基(1∶9);高糖组:在肌酐产物组的基础上加入10%葡萄糖;ATP组:在肌酐产物组的基础上，加入2．5%ATP;谷胱甘肽(GSH)组:在肌酐产物组的基础上，加入5 mmol/L GSH;细菌自身代谢物组:在完全培养基中加入细菌及不含肌酐的无蛋白培养基共同孵育的上清液(9∶1);空白组:只加入完全培养基，不加入细胞，用于调零。各组均于5%CO2培养箱中37℃培养48 h。

1．2．2 细胞增殖情况检测 采用MTT法。每孔加入MTT 10μL，培育4 h，甩板弃去培养液，加入DMSO 200μL，室温避光放置30 min显色。采用酶联仪检测各组570 nm波长处的OD值。实验重复3次。

1．2．3 统计学方法 采用SPSS13．0软件进行统计分析，数据以¯±s表示，组间两两比较采用方差分析，P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

对照组、肌酐组、肌酐产物组、高糖组、ATP组、GSH组、细菌自身代谢物组细胞570 nm波长处OD值分别为 0．254 ± 0．025、0．231 ± 0．018、0．183 ±0．030、0．166 ± 0．023、0．184 ± 0．028、0．261 ± 0．028、0．232 ±0．012;肌酐产物组与对照组、肌酐组、细菌自身代谢物组、GSH组比较，P均＜0．01;GSH组与对照组比较，P ＜0．01。

3 讨论

细胞增殖受多方面的影响，其中能量供应相当重要。有文献报道，肠道细菌作用于肌酐后的降解产物为甲胺，即肌酐在肠道细菌分泌的肌酐酶的作用下水解为肌酸，肌酸经甲基甘氨酸代谢为甲胺。这个代谢途径在尿毒症患者体内被大大加强。甲胺的代谢毒性强，对神经系统、脉管系统、视网膜等都有较强的毒性。甲胺被吸收入血，在氨基脲敏感的胺氧化酶(SSAO)的作用下，形成甲醛、过氧化氢［1］。SSAO广泛存在于血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、血浆及血清中。SSAO代谢过程中生成氧化物质，消耗过多的还原物质。所以，细菌作用下的肌酐代谢产物为强氧化剂。当其与肾小管上皮细胞共同培养，将使上皮细胞膜上的葡萄糖载体、ATP酶及胞内一些与葡萄糖代谢相关的酶氧化损伤，影响肾小管上皮细胞对葡萄糖、ATP的利用，进而抑制增殖。为了进一步证实上述观点，本研究分别向肌酐产物组中加入葡萄糖、ATP、GSH，以观察肌酐产物组细胞生长抑制情况是否纠正。结果显示，加入葡萄糖和ATP的细胞生长抑制情况完全没有改善，而且，加入葡萄糖后细胞生长抑制更明显，OD值较肌酐产物组低，但无统计学意义。这可能与除葡萄糖利用障碍外，高糖本身对肾小管上皮细胞增殖也有抑制作用有关［2］。文献报道，高糖刺激肾小管上皮细胞产生氧自由基，使氧化应激增强［3］，加入ATP后，细胞生长抑制情况亦不能改善。肾小管上皮细胞不能利用ATP，胞内能量相对不足。本研究中，加入GSH组细胞增殖抑制情况明显改善，OD值与正常对照组比较没有统计学差异。这说明GSH能改善肌酐产物对肾小管上皮细胞增殖的抑制作用。肌酐产物可减少上皮细胞内的GSH。肾小管上皮细胞内的GSH浓度由在细胞内合成的GSH、从细胞外摄取的GSH和通过氧化还原反应GSSG还原的GSH这三方面决定。传统观点认为:肾小管上皮细胞可通过腔面刷状缘将GSH分解成氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸)，重吸收后再合成;GSH也可通过细胞基底侧经运输蛋白介导直接吸收整个GSH。但体外研究表明，肾小管上皮细胞摄取氨基酸再合成GSH较慢，主要依靠从细胞外摄取完整的GSH，而不是细胞本身自身合成的GSH。GSH改善生长抑制的原因为:外源性GSH清除反应性氧类，减少强氧化剂丙二醛的产生，防止酶蛋白中巯基的氧化和不饱和脂肪酸的氧化损伤［4，5］。GSH对氧化性损伤有保护作用，它是细胞内的主要抗氧化物质，它能提供含巯基的半胱氨酸，结合自由基等有害物质，清除过氧化物，抗脂质过氧化，减轻自由基对肾小管细胞的损伤［6］。

本研究结果表明，肾小管上皮细胞增殖抑制在慢性肾功能衰竭发病中发挥重要作用。肌酐产物通过诱导肾小管上皮细胞增殖抑制，促进肾小管萎缩，加剧肾功能衰竭，这是慢性肾功能衰竭肾功能恶化的机制之一。葡萄糖、能量利用障碍及GSH减少是引起肾小管上皮细胞增殖抑制的重要因素。上述研究结果有助于我们寻找慢性肾功能衰竭新的特异性的治疗方法，如抗氧化剂GSH的应用等。

［1］Conklin DJ，Cowley HR，Wiechmann RJ，et al．Vasoactive effects of methylamine in isolated human blood vessels:role of semicarbazide-sensitive amine oxidase，formaldehyde，and hydrogen peroxide［J］．Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2004，286(2):H667-H676．

［2］牛敏，常明，刘淑馨．高糖对体外培养肾小管上皮细胞增殖的影响［J］．辽宁实用糖尿病杂志，2003，11(2):22-23．

［3］肖曼，董吉祥．还原型谷胱甘肽对高糖环境中人肾小管上皮细胞保护作用的研究［D］．苏州大学硕士学位论文，2007，4-22．

［4］Baek SM，Kwon CH，Kim JH，et al．Differential roles of hydrogen peroxide and hydroxyl radical in cisplatin-induced cell death in renal proximal tubular epithelial crlls［J］．J Lab Clin Med，2003，142(3):178-186．

［5］周萍，赵广成，吴玉斌，等．氧化应激对大鼠肾小管上皮细胞生物学行为的影响及L-EGCG的保护作用［J］．医学临床研究，2010，27(10):1804-1808．

［6］顾取良，吴梧桐．谷胱甘肽药理和临床研究新进展［J］．药理生物技术，2001，8(1):47-50．