Nrf2-ARE通路调控减轻器官缺血再灌注损伤机制的研究进展

李智涛，黄汉飞，曾 仲

(昆明医科大学第一附属医院，昆明650032)

缺血再灌注损伤(IRI)是指缺血缺氧器官或组织细胞损伤在恢复血供氧供之后反而加重的现象。核转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)—抗氧化反应元件(ARE)是目前为止发现的、最为重要的内源性抗氧化体系，是机体重要的自我防御系统，激活Nrf2-ARE信号通路可增加细胞抗氧化蛋白表达，通过抗凋亡、抑制线粒体膜通透性转换(MPT)、减轻炎症等机制减轻IRI。现将Nrf2-ARE信号通路的调控方式及其减轻IRI的机制综述如下。

1 Nrf2-ARE信号通路

1．1 Nrf2的基本结构 Nrf2属于CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族成员(CNC-bZIP)，含有一个基本亮氨酸结构域。该家族成员还有P45、P53、Nrf1、Nrf3、Bach1、Bach2。Nrf2含 Neh1～Neh6共6个结构域，Neh3是Nrf2发挥转录活性必不可少的部分，Neh4、Neh5可与共激活因子结合蛋白结合，协同参与Nrf2发挥转录活性［1］。Neh2结构域内的DLG、ETGE序列与Keap1二聚体中的DGR结构域结合，形成“门闩—铰链”结构，发挥Keap1对Nrf2的活性调控作用［2］。Neh1区可以与 sMaf蛋白结合形成Nrf2-sMaf异源二聚体，结合ARE启动子，启动多种抗氧化蛋白的转录。研究认为，Nrf2发挥转录活性需要与其他亮氨酸拉链蛋白形成异源二聚体［3］，如Jun、sMaf。

1．2 Nrf2的活性调控 Nrf2的活性调节主要依靠Keap1的负性调节及磷酸激酶对Nrf2的磷酸化调节，此外P21、PGAM5也参与Nrf2的活性调控。

生理情况下，Nrf2被Keap1锚定于胞质的肌动蛋白，Keap1-Nrf2复合物可作为Cul3/Rbx-E3适配底物被泛素化，进而被26S蛋白酶降解，从而维持胞内Nrf2低水平。Keap1结构上是同源二聚体蛋白，每个单体均含BTB、DGR、CTR、IVR四个结构域，两个BTB连接Keap1二聚体单元，与Nrf2的Neh2区的DLG、ETGE形成“门闩—铰链”结构。Keap1的IVR结构域有大量半胱氨酸残基(Cys)，ROS、亲电物质、重金属、NO可使Cys氧化或亚硝基化，Keap1构象因此发生变化，此时DLG与DGR连接的“门闩”断开，Nrf2不能继续被泛素化降解，继而新合成Nrf2转位至细胞核发挥转录活性。Keap1是目前发现的Nrf2最重要的负性调控因子，Keap1敲除小鼠因Nrf2过度激活，出生后仅能生存几天［4］。这间接证明了Keap1的重要性，其他调控因子则没有类似作用。

此外，在Nrf2编码区存在两个类ARE元件［5］，可能是Nrf2的正反馈调节机制。Lo等［6］研究证实，线粒体甘油酸异构酶PGAM5可结合Keap1-Nrf2复合体形成三元复合物，将Nrf2束缚在线粒体内发挥Nrf2活性负性调节作用，敲除PGAM5和Keap1基因均可激活Nrf2转录活性。P21可以与Keap1竞争性结合 Nrf2的 DLG序列，打开“门闩”，稳定Nrf2，激活 Nrf2 转录活性［7］。

1．3 Nrf2的磷酸化调节 蛋白激酶C(PKC)、有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)、磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)均可直接磷酸化Nrf2而激活其转录活性，目前已明确Nrf2的Ser40可被PKC磷酸化激活［8］，Ser40磷酸化后可以导致Keap1与Nrf2亲和力降低。实验证明，PKC、JUNK、ERK、MAPK 均参与了Nrf2 的激活［9，10］。

Nrf2的磷酸化还可介导Nrf2的负性调节，在Nrf2转录活性被激活的同时，GSK-3β丝氨酸残基被PKC磷酸化，磷酸化的GSK-3β使Fyn磷酸化，磷酸化的Fyn进入胞核，使Nrf2的酪氨酸残基Tyr56磷酸化，磷酸化的Nrf2转至胞质，失去转录活性，再次被泛素化降解［11］。

2 Nrf2-ARE与IRI

2．1 增加血红素氧合酶-1(HO-1)表达 HO-1是一种应激蛋白，是催化血红素降解的起始酶和限速酶。HO-1是重要的自由基清除剂及抗IRI因子，具有抗氧化、抗炎和抑制血小板聚集作用。基因转染和药物激活均可通过过表达HO-1减轻肝IRI。对脑［12］、肾脏［13］、神经［14］、肠［15］等组织 IRI的研究发现，激活Nrf2/ARE信号通路可以诱导HO-1过表达，产生保护性作用。

2．2 增加GSH合成 Nrf2启动下游基因可以增加多种GSH合成酶类，如γ-谷胺酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)。γ-GCS是谷胱甘肽(GSH)从头合成途径中的限速酶，从头合成途径是GSH合成的主要途径。此外Nrf2还可以增加谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S转移酶合成，维持GSH还原系统的稳定性［16］。在通过激活 Nrf2 减轻肾 IRI［13］、肠缺血所致肝损伤［15］的研究中，证实 γ-GCS、GR、Gpx、GCL具有保护作用。在细胞缺氧复氧损伤研究中发现，激活Nrf2可以增加GSH合成，抑制细胞凋亡。

2．3 增加过氧化物歧化酶(SOD)表达 SOD是清除过氧化物的重要酶类。外源性导入SOD或基因转染造成SOD过表达均可减轻肝IRI损伤［17］。在Nrf2 减轻肠缺血肝损伤［15］、脑 IRI［12］、肾 IRI［18］、心IRI的研究表明，激活Nrf2可增加组织SOD含量及活性。这可能是Nrf2减轻IRI损伤的机制之一。

2．4 增加醌氧化物还原酶1(NQO1)表达 NQO1是体内的重要抗氧化因子，参与维生素E、辅酶Q、维生素K3的还原，在抗肿瘤、清除重金属、酚类化学物、减轻器官缺血再灌注方面发挥重要作用。抗氧化基因ARE元件是NQO1的启动元件之一，激活Nrf2/ARE通路可以增加 NQO1表达，并在脑IRI［12］、肾 IRI［13］中呈现出保护作用。

2．5 增加硫氧还蛋白(Trx)表达 Trx是一类小分子多功能蛋白，与硫氧还蛋白还原酶、NADPH共同组成硫氧还蛋白还原系统。Trx可通过还原含巯基底物、直接清除自由基、维持GSH还原态，抑制细胞凋亡、抑制白细胞趋化、增加线粒体膜电位来减轻IRI［19］。Trx是Nrf2的下游基因，激活Nrf2可增加 Trx表达［20］，这可能是激活Nrf2、减轻IRI的机制之一。

2．6 抑制通透性转换(MPT) 线粒体通透性转换孔(PTP)是位于线粒体内外膜之间非选择性高导电性通道，生理情况下大部分时间处于关闭状态，病理情况下，ROS、高Ca2+可导致PTP开放，PTP开放的过程称为MPT，此时分子量＜1．5 kD的分子可自由进出线粒体，导致线粒体基质渗透压不平衡、线粒体内Ca2+释放入胞质、细胞色素C和凋亡诱导因子释入胞质，导致细胞凋亡或死亡。多种ARE诱导剂可通过激活 Nrf2抑制 MPT［21］。但抑制MPT是否是Nrf2减轻IRI损伤主要机制还待研究。

2．7 其他 Nrf2还具有减轻炎症反应的作用。Ichihara等［22］通过敲除Nrf2基因研究小鼠下肢IR，Nrf2－/－鼠与Nrf2-WT比较，前者炎症细胞浸润程度更高，黏附分子、MCP-1、TNF-α、血管生成因子mRNA水平更高。ARE经典诱导剂SFN则可以激活Nrf2，减轻LPS诱导的炎症反应，明显下调iNOS、Cox-2，减少 TNF-α、IL-β、IL-6 等 LPS 诱导炎症因子［23］。Nrf2还具有抗凋亡作用，在 HepG2细胞培养液中加入t-BHQ预处理，可明显激活Nrf2，进而增加Bcl-2表达发挥抗凋亡作用［24］。Chuanxi用钴原卟啉(CoPP)处理人心肌干细胞(hCSCs)，显现抗凋亡作用，其机制为CoPP增加hCSCs细胞内HO-1、COX-2 及抗凋亡因子 Bcl2、Bcl2-A1、Mcl-1 的表达，而这种抗凋亡作用通过Nrf2 ShRNA沉默Nrf2基因则不复存在［25］。

Nrf2-ARE信号通路是机体重要的防御通路，在心、肾、四肢、脑、神经、肺等脏器组织IRI中起保护作用。Nrf2-ARE减轻IRI的机制与其编码的大量抗氧化蛋白以及抗炎、抗凋亡、抑制MPT有关。预缺血处理是经典的减轻IRI方法，预缺血处理可以激活Nrf2-ARE通路，但激活Nrf2-ARE通路是否是预缺血处理发挥IRI保护性的根本机制还有待研究。随着研究的深入，相信会找到更为有效的减轻IRI的方法。

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