2型糖尿病葡萄糖转运蛋白4与氧化应激的研究进展

戚琛晔,马灵筠,席守民

氧化应激是指活性分子，例如活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)以及活性氮簇(reactive nitrogen species, RNS)等的过度生成，从而造成体内活性氧类生成与抗氧化防御功能之间平衡的紊乱。2001年Brownlee提出2型糖尿病及其血管并发症有共同的发病机制——氧化应激，作为糖尿病及其慢性并发症的罪魁祸首，贯穿于整个发病过程中。2 型糖尿病是一种复杂的多因素疾病，其发病与许多环境因素，包括老龄、高热量食物摄入过度、运动量减少、肥胖等有关。近年来各方面的研究显示，氧化应激是糖尿病及其并发症发生发展的重要因素之一。本文就氧化应激对葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的影响作用进行阐述。

1 GLUT4概述

GLUT4是一种分子量为45～55 kD，含509个氨基酸单一多肽链的糖蛋白，基本结构是由12个跨膜片段组成含有2个较大的环形结构，其中一个定位于第1、第2跨膜节段的细胞外区域，另一个定位于第6、第7跨膜节段的细胞内区域，其氨基末端及羧基末端均位于细胞膜的胞浆面。1980年就有报道说，大鼠脂肪细胞胰岛素可以触发糖转运体从细胞内贮存到细胞质膜的易位。这种易位假说后来被证实。确定GLUT4是这些细胞中的主要葡糖转运体。GLUT4是脂肪细胞和骨骼肌细胞协助葡萄糖转运的主要蛋白质。在基础状态下，90%位于细胞内的一些特定囊泡样结构中，这些结构被称作GLUT4储存囊泡(GLUT4 storage vesicles，GSVs)。在胰岛素信号或运动等的刺激下，通过激发一系列的级联反应，细胞内的GLUT4易位到细胞外膜上，促进葡萄糖的转运，从而使血糖降低。在胰岛素含量下降时，细胞通过内吞作用将GLUT4运回细胞内，贮存于囊泡中，恢复静息状态。在运动或进食后，GLUT4转运葡萄糖的效率可以比平时提高10～40倍，以满足肌肉运动时向骨骼肌细胞快速提供能量，或餐后快速把血液中的糖转运至细胞内[1]。许多观察表明，GLUT4在全身葡萄糖体内平衡中起着至关重要的作用。

2 GLUT4相关信号通路

2.1PI3K/Akt途径在胰岛素信号通路中，胰岛素结合其受体使胰岛素受体底物(IRS)的多个酪氨酸残基磷酸化，从而引起磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的活化。活化的PI3K产生第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，激活3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)，PDK1激活蛋白激酶B(PKB，又称Akt)。Akt可通过提高胰岛素表达、提高胰岛素受体活性、强化GLUT4对胰岛素的反应性、提高Akt底物蛋白160(ASl60)的表达和活性与GLUT 4构成嵌合体等机制促进GLUT4蛋白易位[2]。PI3K/Akt是调控胰岛素刺激的GLUT4转位的主要信号通路。近年来通过采用基因敲除等技术，揭示PI3K的催化亚基p85以及调节亚基p110对于调控葡萄糖代谢中的重要作用。p85调节亚基有p85α～p85β，p55γ～p55α和p50α 5种亚基，在GLUT4囊泡中只含有p85α亚基。p85α一方面通过与催化亚基 p110 结合抑制P110的活性，从而介导胰岛素或其他生长因子的信号传导，另一方面游离的p85对胰岛素信号通路起负调控作用。因此，p85和p110的比例对胰岛素敏感性起着重要的调控作用。当有胰岛素刺激时，IRS上酪氨酸磷酸化，促使p85α解除对P110的抑制作用，P110催化膜磷脂生成PIP3，激活Akt或非典型性蛋白激酶C(aPKC)，促进GLUT4的转位。糖原合酶激酶-3(GSK-3)是受Akt调控的重要下游分子，并且对IRS-1的活性具有抑制作用。Lochhead 等[3]研究证实，GSK-3抑制剂可以促进大鼠骨骼肌细胞内的GLUT4向细胞膜转位，提高骨骼肌中胰岛素刺激的葡萄糖转运。这提示GSK-3是PI3K/Akt信号通路调控GLUT4的下游信号分子之一。

2.2CAP/Cbl途径CAP/Cbl途径是胰岛素信号通路中的一个分支，由胰岛素受体、原癌基因蛋白Cbl及CAP衔接蛋白等组成，是参与葡萄糖转运的信号途径。其中CAP是原癌基因Cbl的相关蛋白，其羧基端含有3个相毗邻的SH3区段，Cbl通过与其中一个SH3结构域相互作用形成CAP/Cbl异源二聚体，并通过CAP与胰岛素受体相连，促使Cbl的酪氨酸磷酸化。活化后的Cbl与小结合蛋白(Crk)和富含脯氨酸结构域的鸟苷交换因子(C3G)相互作用，形成CAP-Cbl-Crk-C3G的复合物。此复合体特异地与一种称为脂筏(lipid rafts)的亚结构域发生作用，在不依赖PI3K信号通路的情况下，从而特异性地促进GLUT4的转位。穆颖等[4]研究证实，GLUT4作为骨骼肌细胞的摄取葡萄糖的限速蛋白受Cbl、TC10的信号偶联作用调控，而且存在时间剂量依赖关系；用β-CD封闭细胞膜上的脂筏后，cbl、TC10的信号通路也会受到抑制，GLUT4 mRNA表达丰度下降。这说明CAP/Cbl/TC10途径也可以独立地刺激诱导GLUT4蛋白的转位。

2.3AMPK激活途径AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是细胞内重要的能量代谢感受器，属于代谢敏感性蛋白激酶家族，是调节多种代谢过程的重要信号分子。运动可以刺激骨骼肌AMPK活性的升高，并通过增加其下游级联激活信号引起GLUT4囊泡GSVs向细胞膜的转位。运动时，肌肉的收缩会导致骨骼肌中ATP减少、AMP增加，从而激活AMPK。在安静状态下，骨骼肌中AMPK可以被AICAR激活，促进葡萄糖的转运。AICAR，全称为5-Aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside，也称AICA Riboside或Acadesine，是一种可通透细胞膜AMPK的激活剂。众多研究发现，AICAR可以引起GLUT4表达水平的明显增加，同时胰岛素刺激后葡萄糖摄入也明显增加[5-6]。这表明AMPK的激活是提高GLUT4表达的机制之一。有实验研究表明，通过AICAR使PGC-1α上调会同时伴随GLUT4的表达上调。这说明AICAR诱导GLUT4表达可能是由PGC-1介导的。同时，运动诱导的GLUT4的转位也与AMPK有关[7-8]。然而，近来有关AMPK在葡萄糖转运中的作用依旧备受争议。有文献表明，AICAR和瘦素介导的胰岛素抵抗可通过AS160磷酸化和GLUT4转运得以迅速改善，但是不是由AMPK的磷酸化引起的[9]。Viollet 等[10]的研究发现，AMPK可能在葡萄糖转运过程中并不发挥作用。Lemieux[11]等认为，AMPK途径并不诱导GLUT4的转位，但是能通过刺激p38MAPKα和β诱导骨骼肌中葡萄糖的摄取。

2.4联合作用GLUT4表达与转位的调节与多种因素有关。目前认为，运动和胰岛素浓度是调节GLUT4的两个最重要因素。运动和胰岛素都可以通过激活PI3K和MARK途径刺激GLUT4的表达，其中胰岛素对于两条途径的激活作用要强于运动；同时运动与胰岛素对这两条途径的激活作用存在叠加效应。Chen[12]等发现运动可能是同时激活了aPKC和AMPK信号通路使GLUT4蛋白的表达增加。在GLUT4转位的调节上，胰岛素刺激GLUT4的转位主要是通过胰岛素信号途径中的PI3K途径和CAP/Cbl途径，而运动诱导的GLUT4的转位主要是通过AMPK、MAPK等信号实现的。林强[13]等人研究显示，电刺激诱导的骨骼肌收缩可促进GLUT4的转位，这一过程中AMPK和PI3K都参与了信号转导，只抑制其中一条信号通路不能阻止GLUT4的转位。也有研究表明，血管紧张素Ⅱ(angiotensin II, Ang II)抑制胰岛素介导的GLUT4易位时至少经过了两个途径：一是通过抑制IRS-1/2瞬间激活ERK1/2，二是直接抑制Akt硝化。

3 氧化应激对GLUT4的表达的影响

氧化应激是指体内高活性分子，主要指活性氧自由基(ROS)和活性氮自由基(RNS)产生过多，与抗氧化防御系统作用失衡，从而导致组织损伤。ROS主要包括不带电粒子如超氧阴离子自由基和羟自由基，以及带电粒子如过氧化氢。ROS激活许多氧化应激有关的信号通路，作用类似于第2信使信号分子：①丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen．activated protein kinases，MAPK)信号传导途径；②P13K/Akt途径；③磷脂酶C和蛋白激酶C(PKC)；④核因子(NF-κB)和共济失调—毛细血管扩张症突变(ATM)激酶；⑤其他的信号传导分子和途径：JAK/STAT途径、C-Abl酪氨酸激酶、P66shc适配蛋白和热休克蛋白的表达。

GLUT4的表达受多种因素的调控，其中包括胰岛素浓度、运动、高脂高糖饮食等。目前认为，线粒体ROS的产生会加重骨骼肌胰岛素抵抗，可能使胰岛素信号通路受阻，GLUT4的表达降低，导致胰岛素抵抗。研究表明，2型糖尿病大鼠骨骼肌中存在明显的氧化应激损害，并伴随着胰岛素抵抗的明显增加，结果显示与GLUT4的表达降低有关。氧化应激可引起3T3-L1脂肪细胞中GLUT4表达下降，从而导致胰岛素抵抗。Pessler等将3T3-L1脂肪细胞暴露于低微摩尔浓度的H2O2中, 4 h后GLUT4 mRNA 表达减少, 从氧化细胞核蛋白提取物中分析显示结合GLUT4启动子的胰岛素反应元件减少, 表明氧化应激通过减弱核蛋白与GLUT4的启动子的胰岛素反应元件结合, 减少了GLUT4的表达，使用还原剂可以部分恢复其结合力[14]。

4 氧化应激对GLUT4的转位的影响

有证据表明，Akt蛋白对ROS极为敏感，使PKB/Akt活性受ROS调节，自由基可以破坏其磷酸化位点影响其活化表达，而复合抗氧化剂干预既可通过全面改善机体抗氧化能力，又可以直接保护PKB/Akt免于氧化损伤，使p-Akt/Akt的表达较正常对照组显著增加，激活下游GLUT4从细胞内向膜的转位，促进肌肉和脂肪组织对葡萄糖的摄取。人类肥胖相关新基因LYRM1的过表达会通过抑制PI3K与Akt的磷酸化导致GLUT4转位损伤，抑制葡萄糖的摄取，引起胰岛素抵抗[15]。α-硫辛酸(α-Lipoic acid，α-LA)是一种常见的超强抗氧化剂，可以提高细胞的葡萄糖转运能力。在过表达LYRM1基因的3T3-L1脂肪细胞中，α-硫辛酸的预处理显著增加了胰岛素诱导的GLUT4易位和葡萄糖的摄取，同时ROS水平有明显的下降[16]。这提示氧化应激可能是通过抑制PI3K/Akt途径引起GLUT4的转位下调。Shibata[17]等人研究发现百草枯诱导的氧化应激抑制PI3K上P110的活性，从而削弱了3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取。这一结果显示，PI3K上P110亚基很可能是氧化应激抑制PI3K活性以及GLUT4转位的主要靶点。

氧化应激引起胰岛素抵抗是一个较复杂的多途径的过程，其主要环节是氧化应激产生的ROS，通过增强丝/苏氨酸蛋白激酶等信号分子的活性，干扰GLUT4介导的葡萄糖运输。然而，氧化应激诱导引起的胰岛素抵抗究竟是由于GLUT4的转位障碍还是GLUT4的表达不足尚不清楚。Garvey[18]等人研究发现只要存在胰岛素抵抗，GLUT4的量也无减少，而转位作用却发生了障碍。因此，GLUT4与氧化应激之间相关性的研究对于阐明氧化应激诱导引起胰岛素抵抗的机制具有重要意义。

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