加工肉制品中杂环胺的检测方法及抑制措施的研究进展

秦 川，郑宗平，曾茂茂，何志勇，陈 洁

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

杂环胺(heterocyclic aromatic amines，HAAs)是肉类等富含蛋白质的食物在烹调过程中经过一系列的化学反应产生的致癌、致突变的化合物［1］。1977年，日本科学家在烤焦的牛肉、鱼的表面发现潜在致突变物质［2］。此后，人们对于此类烹调产生的致癌物质的研究逐渐深入，此类致癌物质即为杂环胺。杂环胺属多环芳烃类化合物，对于富含蛋白质的食物，300℃的加热温度是产生不同种类杂环胺的分界限，当温度大于300℃时，蛋白质受热分解产生的杂环胺为氨基咔啉类(amino-carbolines)［3］;温度小于 300℃时产生的杂环胺为氨基咪唑氮杂芳烃类(aminoimidazole-azaarenes，AIAs)。氨基咔啉类杂环胺可分为α-咔啉类，β-咔啉类，γ-咔啉类和δ-咔啉类;而AIAS类杂环胺则可分为喹啉类(quinoline)，喹喔啉类(quinoxaline)和吡啶类(pyridine)。按极性划分，杂环胺可分为极性杂环胺和非极性杂环胺。目前发现的杂环胺超过25种，其缩写分别为:DMIP、1，5，6-TMIP、3，5，6-TMIP、PhIP、4′-OH-PhIP、IFP、iso-IQ、IQ、MeIQ、IQ、MeIQ、IQ［4，5-b］、4-MeIQx、8-MeIQx、7，8-DiMeIQx、4，8-DiMeIQx、4-CH2OH-8-MeIQx、TriMeIQx、IgQx、7-MeIgQx、6，7-DiMeIgQx、7，9-DiMeIgQx、Phe-P-1、AαC、MeAαC、Harman、Norharman、Trp-P-2、Trp-P-1、Glu-P-2、Glu-P-1、Orn-P-1、Cre-P-1、Lys-P-1。肉制品中的杂环胺含量因肉的种类，肉的加工、烹调方式的不同存在较大差异，但总体上处于ng级别。鉴于肉制品中的杂环胺含量极低，且易受到共提物的影响，行之有效的检测方法显得尤为关键，高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法成为近些年杂环胺检测的主流方法。与此同时，随着公众对健康饮食需求的日益提高，如何对肉制品中致癌、致突变的杂环胺进行有效抑制也成为当前的一个研究热点。本文概述了近二十年来肉制品中杂环胺的提取方法、检测技术及抑制措施。

1 肉制品中杂环胺的提取及检测方法

杂环胺仅以痕量水平(ng/g)存在于肉制品中，因此合理、高效的提取和检测方法对于杂环胺的分析和研究至关重要。

1.1 肉制品中杂环胺的提取方法

肉制品中杂环胺的提取，第一步包含一个溶解的过程，采用不同的溶剂均质样品。溶剂分为有机溶剂和无机溶剂两大类:有机溶剂包括丙酮、乙酸乙酯、甲醇等;无机溶剂包括水、盐酸、氢氧化钠等。第二步通常为用离心或过滤的方式除去肉制品中的蛋白质等杂质。而除杂最常用的技术为液液萃取，如果均质溶剂为有机溶剂，那么萃取溶剂通常采用盐酸;如果均质溶剂为无机溶剂，那么萃取溶剂通常采用有机溶剂，如二氯甲烷［4-5］、乙酸乙酯［6-7］。而液液萃取通常与吸附剂萃取相结合。吸附剂通常采用硅藻土［4］，也有报道采用蓝色人造纤维［8］。在对杂环胺进行初步的前处理后，由 G A Gross［4］等提出的固相萃取法成为对杂环胺进行进一步分离和纯化的常规方法，包括阳离子交换固相萃取和反相固相萃取。阳离子交换固相萃取的原理是化合物上与硅胶键合相的带电基团之间的相互吸引，而反相固相萃取的原理是分析物的碳氢键与硅胶表面官能团的吸附作用。如G A Gross［4］等使用丙基磺酸柱(PRS)和反相C18柱进行固相萃取;而 C Messner［7］等则使用 MCX 混合阳离子交换萃取柱进行固相萃取。固相萃取的步骤一般包括柱子的活化、减压干燥、上样、清洗和洗脱。固相萃取后，对样品进行浓缩，通常使用氮气吹干后再用甲醇溶解检测。

1.2 肉制品中杂环胺的检测方法

肉制品中杂环胺的检测方法包括气相色谱法(GC)，气相色谱串联质谱法(GC-MS)，高效液相色谱—紫外检测法(HPLC-UV)，高效液相色谱—荧光检测法(HPLC-FD)，高效液相色谱—电化学检测法(HPLC-ECD)，高效液相色谱串联二级质谱法(HPLC-MS-MS)，超高效液相色谱串联二级质谱法(UPLC-MS-MS)等。

1.2.1 气相色谱法(GC) 绝大多数杂环胺都不易挥发且具有一定的极性，而且由于其对色谱柱的强吸附性易造成峰的拖尾，在较低浓度时杂环胺不易被检出。因此，气相色谱检测之前通常要进行衍生化处理。杂环胺经衍生化处理后，不仅极性降低，而且挥发性、灵敏度、分离度也有较大提高［9］。

因为杂环胺中存在氮原子，气相色谱法检测杂环胺通常采用氮磷检测器(NPD)。H Kataoka［10］等人通过一种简单、快速的衍生化方法，可以用氮磷检测器检测出10种杂环胺。但是AαC和Glu-P-2两种杂环胺的色谱图重叠在一起无法分开。

气相色谱技术虽然具有较高的分离性能，但只有少数杂环胺能经衍生化处理，且当样品中杂环胺浓度太低时，也存在着定量不准确的缺陷，因此气相色谱技术在杂环胺检测领域应用较少。

1.2.2 气相色谱法串联质谱法(GC-MS) 由于结合了气相色谱仪的高分离性能和质谱仪的高选择性和灵敏度，气相色谱串联质谱(GC-MS)是最好的在线检测方法之一［9］。有些报道［10-11］已经证实杂环胺可以用GC-MS进行检测，但是也仅限于少数能经衍生化处理的杂环胺检测。L Warzecha［12］等用五氟丙酸酐(PFPA)对杂环胺进行衍生;S Casal［13］等用添加1%叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMCS)的三氟乙酰胺(MTBSTFA)对杂环胺进行衍生。另外，也有使用乙酸、三氟醋酸等衍生化试剂。

1.2.3 高效液相色谱法(HPLC) 所有的杂环胺都具有紫外吸收波长，且其具有一定的极性、不易挥发的特点，以及高效液相色谱—紫外检测法(HPLCUV)操作相对简便，不需要像气相色谱法那样进行衍生化处理，使其成为过去数十年来用于杂环胺检测的常规方法。对于有些能产生荧光信号的杂环胺，也可以通过荧光检测器(FD)来进行检测。然而通常情况下，荧光检测器(FD)作为紫外检测器(UV)或二极管阵列检测器(DAD)的补充以排除杂质峰的干扰和更好的定量。高效液相色谱法的流动相一般采用p H3.2～3.6的三乙胺磷酸缓冲液和乙腈。高效液相色谱法虽然是杂环胺研究最普遍的方法，最高可同时检测出十几种杂环胺，但也存在着灵敏度低，定量不准确的缺陷。

应用于高效液相色谱法测定杂环胺的反相色谱柱也是多种多样，其中TSK gel ODS柱因峰型好，分离度高的特点而应用最为广泛［4，14-18］。G A Gross［4］等采用三元流动相同时分离出12种致突变型杂环胺和2种非致突变型杂环胺harman和norharman。K Puangsombat［17］等用 0.01mol/L 的三乙胺磷酸缓冲液和乙腈进行二元梯度洗脱，对热狗等市售方便肉制品进行杂环胺的含量测定，检测出5种杂环胺:IQ、IQx、MeIQx、DiMeIQx、PhIP。而除了 TSK gel ODS 型色谱柱外，也有许多报道采用其它的色谱柱，如K W Cheng［19］等使用 YMC型 C18色谱柱研究水果提取物对杂环胺的抑制作用，检测3种杂环胺(PhIP、4，8-DiMeIQx、MeIQx)含量的变化。

1.2.4 液相色谱串联质谱法(LC-MS)LC-MS很好地结合了色谱良好的分离能力和质谱的高灵敏度和高选择性，并且通过高效液相色谱串联二级质谱(LC-MS-MS)可以达到更佳的选择性［20］。目前有3种离子化技术应用于LC-MS中:热喷雾(TSI)技术、电喷雾(ESI)技术和大气压化学电离(APCI)技术，而 ESI和 APCI的灵敏度较 TSI更高。J Lee［21］等研究压橄榄油对烤牛肉中杂环胺含量的影响，使用LC-MS检测杂环胺含量变化，采用串联单一四级杆检测器(MSD)，流动相为30mmol甲酸铵缓冲液和乙腈，色谱柱为RX-C8型，可同时测定15种杂环胺含量，回收率在35%～70%之间。

近些年来，超高效液相色谱(UPLC)技术迅速发展，超高效液相色谱串联二级质谱(UPLC-MS-MS)广泛应用于杂环胺含量测定［20］，具有分离度高，分析快速的优点。吕美［22］等使用超高液相色谱—电喷雾串联二级质谱(UPLC-ESI-MS-MS)检测添加香辛料的牛肉中三种杂环胺(AαC、Norharman、PhIP)的含量变化，采用乙酸铵和乙腈作为流动相，具有较好的定量效果。E Barceló -Barrachina［23］等使用 UPLCESI-MS-MS对冻干肉制品中的杂环胺进行快速检测，可以在2min内完成对16种杂环胺的检测分析。

2 肉制品中杂环胺的抑制措施

杂环胺具有潜在的强致癌和致突变作用，并在动物实验中已证实具有致癌和致突变作用，对人体健康也有可能带来危害，因此如何抑制肉制品中杂环胺的产生是当前的一个研究热点。目前的研究主要集中在采取合理的烹调方式，降低烹调温度和时间，添加香辛料，添加人工或合成的抗氧化剂和添加植物提取物等方面。

2.1 合理的烹调方式

近些年，许多研究表明，烹调方式对肉制品中杂环胺的种类、含量有很大的影响［24-27］。F Oz［24］等考察了不同烹调方法对鸡肉和鱼肉体系中杂环胺产生量的影响，分别采取微波加热、烤箱、电炉、平底锅煎炸和烧烤的方法。结果表明，微波加热产生的杂环胺最多，其次为平底锅煎炸和烧烤，而使用烤箱和电炉则产生较少的杂环胺。G Z Liao［25］等分别使用碳烤 (20min，200℃)、烤 箱 (20min，200℃)、油 炸(10min，180℃)、平底锅煎炸(5min 每面，180℃)的方法烹调鸡脯肉和鸭脯肉。结果表明，碳烤的鸡脯肉中杂环胺含量最高，达到112ng/g，总体而言，碳烤和平底锅煎炸产生的杂环胺相对较多。产生杂环胺含量过高可能的原因是:肉类与受热平面直接接触，如平底锅煎炸;温度过高，如烧烤［26］;水分流失，导致一个相对干燥的平面，而其附近的温度更高，且形成的杂环胺的前体物质富集，进而通过一系列反应生成杂环胺［27］。因此，采取合理的烹调方式，避免过高的温度、直接与高温热源接触和水分流失就能有效抑制杂环胺的产生。

2.2 降低烹调温度和时间

研究表明，烹调温度和时间对杂环胺的产生量也有巨大的影响［28-30］。M Bordas［28］等人在冻干肉类提取物和液态肉类提取物的模拟体系中对分别对温度和时间对杂环胺的影响进行了考察，结果表明，较高的温度和较长的烹调时间能够使杂环胺的含量大幅上升。B G Abdulkarim［29］等人对火腿、香肠、腊肠进行了研究，发现85℃没有促进杂环胺的生成，190～230℃杂环胺含量提高 2～5 倍。P Arvidsson［30］等人在肉汁体系中对 IQx，PhIP，MeIQx，7，8-DiMeIQx，4，8-DiMeIQx等多种杂环胺含量在不同温度和时间下进行了测定。结果表明125℃，加热45min，可以检测到IQx;而当温度上升到125～150℃后，多种杂环胺含量急剧上升;随着时间的延长，杂环胺含量继续上升，并逐渐趋于平缓。

2.3 添加香辛料

研究［22，31-35］表明，肉制品中添加香辛料可以显著影响杂环胺的生成。J Damašius［31］等在牛肉中加入罗勒、牛至等香辛料，结果表明，添加罗勒、牛至均导致PhIP的含量升高;而添加罗勒可以降低Trp-p-1的含量，添加牛至却导致Trp-p-1含量的上升;同时添加罗勒和牛至可以降低 Tro-p-2的含量。Z Balogh［32］等在牛肉中加入迷迭香，可以降低PhIP含量。E Persson［33］将迷迭香加入压榨橄榄油中，可以降低牛肉汉堡中HAs含量。F Oz［34］等在高脂肪的肉球中加入黑胡椒，发现225℃的煎炸温度下未添加黑胡椒的肉球产生的PhIP含量高达37.81ng/g;而添加黑胡椒的肉球则未检测出PhIP。黑胡椒对PhIP的抑制效果达100%。K Puangsombat［35］等考察了几种亚洲产香料对煎牛肉中杂环胺的抑制，发现姜黄可以使杂环胺总量降低39.2%，提琴形凹唇姜使杂环胺总量降低33.5%，而高良姜使杂环胺总量降低18.4%。吕美［22］等对中国传统香辛料(高良姜、麻椒、花椒等)对煎炸牛肉饼中杂环胺形成的影响进行了研究，结果表明，高良姜的抑制效果最好，对PhIP的抑制率为100%，且对AαC和Norharman也有较好的抑制作用，抑制率分别为77.27%和77.08%，对煎烤牛肉中杂环胺总量的抑制达到了78.32%。作者进而对6种香辛料清除ABTS自由基的能力和其抑制杂环胺的能力进行线性相关分析，发现不具有相关性，而这与 J Damašius［31］的结论一致，说明香辛料的抗氧化性并不是其对杂环胺存在抑制作用的原因。

2.4 添加天然或人工合成的抗氧化剂

天然抗氧化剂，如维生素、类胡萝卜素、黄酮类化合物等，许多报道表明其对加工肉制品中杂环胺的产生具有明显的抑制效果。D Wong［36］等考察了11 种水溶性维生素(VB1、VB2、VB3、VB5、PM、PN、PL、VB7、VB9、VC、VB12)对模拟体系和煎炸牛肉中两种杂环胺(PhIP、MeIQx)含量变化的影响，结果表明6 种维生素(VB2、VB3、VB5、PL、VB9、VB12)对杂环胺的抑制作用超过40%。K W Cheng［37］等考察了12种酚类化合物对模拟体系和牛肉中杂环胺含量变化的影响，结果表明:柚皮苷、槲皮素等黄酮类化合物均能抑制PhIP的产生;而迷迭香酸、鼠尾草酸等酚酸类化合物则促进了PhIP的产生。进一步研究表明［38-39］，柚皮素(naringenin)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)均可与杂环胺生成的中间产物苯乙醛结合，生成特定的化合物，从而间接抑制了杂环胺PhIP的生成。

而添加人工合成的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)等也对杂环胺的生成有较大影响。C M Lan［40］等研究表明，BHT对杂环胺有轻微的抑制作用。但人工合成的抗氧化剂是否对人体存在潜在的危害，尚存在争议。

2.5 添加植物提取物

目前，大量研究［19，41-44］表明植物提取物对杂环胺也具有明显的抑制作用。K W Cheng［19］等研究4种植物提取物(苹果、接骨木、葡萄、菠萝)对三种杂环胺(PhIP、4，8-DiMeIQx、MeIQx)的抑制作用，结果表明:接骨木和菠萝的提取物具有轻微的抑制作用，而苹果和葡萄的提取物则有较强的抑制作用(约为70%)。M Gibis［41］等在腌泡汁中分别加入大蒜、洋葱、柠檬来研究其对煎炸牛肉中杂环胺的抑制作用，发现三者最佳的抑制效果分别为31.2%，28.6%，14.6%。J Lee［21］等考察了初压橄榄油(EVOO)对烤牛肉中15种杂环胺的抑制作用，结果表明，当EVOO添加量在2～4g范围内时对杂环胺有较强的抑制作用，而添加额外的EVOO则促进了某些杂环胺的生成。I Quelhas［42］等研究了绿茶对四种杂环胺(PhIP、AαC、4，8-DiMeIQx、MeIQx)的抑制作用，将牛肉事先用绿茶浸泡数小时进而煎炸。结果表明绿茶对PhIP和AαC两种杂环胺有较为明显的抑制作用，且随着浸泡时间的变化，杂环胺含量也有较大差异，而4，8-DiMeIQx和MeIQx两种杂环胺的含量则没有明显的变化。

3 结语

近些年，随着人们对于饮食健康要求的日益增大，肉制品中杂环胺的研究也日益深入，而杂环胺的检测技术也逐渐提高，UPLC-MS-MS等先进的分析技术越来越多的应用于杂环胺的检测中。与此同时，杂环胺抑制作用机理的研究也在逐渐发展和深入。相信在不久的将来，一定能够找到简单、经济、实用的抑制杂环胺的措施，并且建立一个完善的加工肉制品中杂环胺的检测标准。

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