真菌毒素免疫分析中新型检测元件的研究进展

贺贞云，何庆华，许 杨

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，中德联合研究院，江西南昌330047)

真菌毒素是由真菌产生的次生代谢产物，主要污染于谷物、饲料以及发酵食品中，已被证实对人和动物具有多种特定器官的毒性以及致癌性［1］。因此，食品中真菌毒素的监控对于保障食品质量安全具有十分重要的意义。检测真菌毒素的方法众多［2－4］，其中免疫检测具有灵敏度高、特异性强、快速方便等优点，特别适合于对真菌毒素污染监控中大批量样本的筛检工作。虽然基于抗体和毒素间特异性结合反应的免疫检测有诸多优点，但是传统的完整抗体有其特定的限制。以建立杂交瘤细胞株生产的单克隆抗体，需要免疫动物，制备技术复杂，费时费工;虽然特异性极强，但是只能与一种抗原决定簇结合，限制了多种真菌毒素的同时检测;易变性及水解，不能在苛刻的环境下使用。基于上述原因，研究人员致力于开发更为廉价、方便制备，或是在极端条件下仍保持结构稳定的检测元件。这些元件可分为重组类检测元件、合成类检测元件和其他元件。重组类检测元件主要是采用基因工程技术得到的重组抗体片段，包括单链抗体、单域抗体、双特异性抗体等。合成类检测元件则是利用化学法合成能与真菌毒素特异性结合的非天然材料，如分子印迹聚合物。除了为超越传统抗体应运而生的新型检测元件之外，还有一些在免疫分析过程中替代真菌毒素本身的检测元件，如抗原模拟表位和抗独特型抗体。本文综述了在真菌毒素免疫分析中有潜在应用价值的检测元件，并对其未来发展方向加以预测。

1 重组类检测元件

抗体可变区中的六个高变区决定了抗体与抗原结合的特异性和亲和力［5］。因此人们通过还原、水解、基因重组等方法分离抗体的可变区，以减小抗体的分子量并保留与其抗原结合的特性。由于重组抗体的生产技术日渐成熟，而且这些重组分子在检测方法中的识别程度越来越高，重组抗体已广泛应用于真菌毒素的免疫检测［6］。抗真菌毒素的重组抗体主要有单链抗体、单域抗体和双特异性抗体等。

1.1 单链抗体

单链抗体是利用基因工程原理将天然抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一条连接肽(linker)连接形成的单链分子。单链抗体特异性高，抗原性低，利于在组织中渗透和扩散、易于基因操作和基因工程大量生产，拓宽了真菌毒素等小分子抗体的应用范围。起初，获得单链抗体的方法主要有两种:一是从杂交瘤细胞扩增抗体的VH和VL，二是从免疫动物的白细胞或脾脏内提取RNA，经反转录后再进行扩增［7］。但两种方法都需要免疫动物，重复了单克隆抗体的制备过程。2005年，Lauer［8］等人通过淘选天然单链抗体噬菌体库获得抗伏马菌素B1单链抗体，因而无需免疫动物。单链抗体与完整抗体相比缺少恒定区，在结构上的差异使得其与真菌毒素结合的亲和力较亲本单克隆抗体相比较弱。Choi［9］等将抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的单链抗体编码基因转入大肠杆菌表达系统，使其与6个组氨酸残基融合表达，表达产物经纯化后测得具有结合抗原的生物学活性，但是亲和力不如抗DON单克隆抗体。Min［10］等表达的抗伏马菌素B1(FMB1)单链抗体亲和力较单克隆抗体低12倍。由于此种单链抗体没有经历体内的亲和成熟过程［11］，一般重组的单链抗体亲和力比单克隆抗体低，在一定程度上限制了单链抗体在食品检测中的应用。因此，为提高单链抗体的亲和力找到一种行之有效的方法是目前亟待解决的问题。Zahnd［12］等采用体外定向进化技术对单链抗体进行改造，结果显示其亲和力提高了8倍。Chang［13］等人成功地在毕赤酵母中表达抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单链抗体，经表面等离子共振技术分析其结合能力，结果显示，原始单链抗体与抗ZEN单克隆抗体的亲和力相当，经密码子优化后的单链抗体亲和力略有提高。单链抗体在毕赤酵母表达系统中的表达与大肠杆菌表达系统相比，产物的溶解性、结合活性和产量都有一定提高。

单链抗体具有分子量低、特异性高、抗原性低、易表达等优点，但其亲和力低，而且表达产物易形成无活性的包涵体［14］。将单链抗体与分子伴侣和折叠酶共表达［15］，或者采用优化表达条件［16－17］，基因突变［6］等方法可以提高表达产物的可溶性及亲和力。

1.2 单域抗体

继单链抗体之后又出现了分子量更低的单域抗体(Single－Domain Antibody)。单域抗体又称纳米抗体，由重链抗体的可变区构成，是来自于骆驼、鲨鱼等动物中天然缺失轻链的抗体。单域重链抗体分子量约15ku，具有易表达、高水溶性、耐高温、耐极度pH等优点，目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域［18］。虽然单域抗体较单链抗体的分子量更低、保守区更少，但却显示出更高的特异性。Doylea P J［19］等建立了抗 15－乙酰基－DON(15－AcDON)单域抗体的噬菌体库，利用大肠杆菌表达系统对淘选得到的阳性克隆NAT－267进行表达，获得了蛋白mNAT－267单体和 pNAT－267五聚体。二者都能特异地与15－AcDON结合，IC50分别为1.24μmol/L和0.50μmol/L，且前者与免疫美洲驼(Llama glama)56天后血清的特异性(IC50为1.42μmol/L)相当。Van Houwelingen［20］等人通过免疫羊驼获得多个抗赭曲霉毒素A(OTA)的单域抗体片段，并用大肠杆菌表达系统表达出具有较高亲和力及特异性的重组单域抗体。其中单域抗体OCH－62分别与赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素B结合的IC50为12和476ng/mL，与其他食品中常见的OTA结构类似物，如苯丙氨酸和香豆素无明显交叉反应，可以代替单克隆抗体应用于食品中OTA的免疫检测。单域抗体在真菌毒素免疫检测中的应用逐渐进入国内研究领域。2010年，涂追［21］成功构建了天然噬菌体单域重链抗体文库，并以DON－MBSA人工抗原为配基，经淘选得到一种可以与DON－MBSA特异性结合的单域抗体。单域抗体作为最新发展起来的小分子抗体以其分子小、溶解度高、热稳定性好、可以重新折叠［22］等优点，克服了单链抗体在原核表达系统中容易形成包涵体的缺憾，随着人们对其研究的深入，单域抗体将在真菌毒素免疫检测中得以广泛应用。

1.3 双特异性抗体

双特异抗体(Bispecific Antibody，BsAb)最早出现于上世纪80年代，主要是采用化学偶联方法制备的鼠源性F(ab’)2以及(IgG)2;到了90年代初，出现了双杂交瘤融合而成的杂交－杂交瘤。目前应用最多的是利用基因重组技术制备的双特异基因工程抗体。双特异性抗体是一类具有双功能的杂交分子，二价抗体中的Fab片段具有不同特异性，能与不同的配体结合。双特异性抗体最初应用于肿瘤的临床治疗，因其具有两个抗原结合位点，其中一个与靶抗原结合，另一个与效应细胞结合，因而引导效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞［23］。如果将两种或两种以上抗真菌毒素抗体的基因整合在一个重组抗体上，就可以制备同时检测两种或两种以上真菌毒素的抗体分子，在真菌毒素检测中具有良好的应用前景。例如，2008年 Wang［24］等构建了一种抗DON和抗 ZEN的双特异性单链抗体，经鉴定其保留了单链抗体对DON和ZEN的亲和力。目前，将双特异性抗体应用于真菌毒素检测的研究还非常少，主要原因有单链抗体的溶解度和稳定性较低［25］，表达蛋白易形成包涵体，连接两个单链抗体片段的linker最佳长度和氨基酸序列还需进行优化［26］。因此对于含两种以上抗原结合位点的多特异性抗体还有待进一步研究。

2 合成类检测元件

设计并合成能够结合真菌毒素的多聚体在真菌毒素检测领域是一个新技术，其中最具代表性的就是分子印迹聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，简称MIP)。分子印迹聚合物是利用分子印迹技术制备的具有与模板分子在空间结构和结合位点上完全匹配的高分子聚合物。1973年Wulff［27］研究小组首次成功制备出MIP，使分子印迹技术产生了突破性进展。Pascale［28］等用衣康酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸盐为交联剂，1－偶氮－双－(环己双－1－甲腈)为引发剂，DON为模板，合成了DON分子印迹聚合物。Turner［29］等用非共价键法合成能与赭曲霉毒素A特异性结合的MIP，并且其亲和力和选择性都较好，他们认为缓冲液的浓度、pH、有机溶剂等因素对MIP的识别作用有重要的影响。尽管MIP作为真菌毒素检测元件的亲和力和选择性都不如相对应的抗体，但因其自身耐受性强、容易制备、能反复使用等优点，在真菌毒素的固相萃取方面已有广泛研究［30－32］。MIP在仿生传感器的研制方面取得了一定进展，其重要应用是取代生物分子作为识别元件，通过待测分子与识别元件的结合，对待测分子实时测定［33］。Yaqub［34］等利用原位聚合法在压电转换器的金电极上合成MIP，作为一种新型人工受体识别阿特拉津(Atrazine)，制成可用于检测农药阿特拉津的化学传感器(“塑料抗体”)，其检测限为20ppb，检测范围较宽，线性较好。但是与其他MIP一样，阿特拉津MIP传感器同样能与其代谢产物和结构类似物结合，交叉反应率高，降低了分子识别的选择性。如果将MIP仿生传感器应用于真菌毒素的检测，对于同时检测多种真菌毒素及其代谢产物(如黄曲霉毒素B1、B2、M1、M2)具有重要意义。然而，目前还没有将MIP应用于真菌毒素检测的商业化产品。原因之一是免疫亲和萃取技术对于分子印迹技术而言是强有力的竞争对手，而且在市场上占有率居高。另外一个原因则是真菌毒素的高毒性和高价格使得MIP的制备过程极其危险，且成本偏高［35］。

3 其他检测元件

真菌毒素不仅对人及动物具有多种特定器官的毒性以及致癌性［36］，而且价格昂贵。因此，人们试图找到一种可以代替真菌毒素标准品的检测元件。目前针对真菌毒素半抗原的研究包括抗原模拟表位和抗独特型抗体。

3.1 抗原模拟表位

噬菌体展示技术是一种将基因表达产物与亲和淘选相结合的技术，它以改造的噬菌体为载体，将待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质的编码基因，使其基因表达产物在噬菌体表面展示，进而通过亲和富集淘选展示特异肽或蛋白质的噬菌体。Thirumala－Devi［37］等从噬菌体展示随机肽库中淘选与抗黄曲霉毒素单克隆抗体MAb 24和MAb 13结合的噬菌体，将其应用于竞争ELISA检测黄曲霉毒素。结果表明噬菌体展示模拟表位可以有效代替纯毒素用于安全、廉价ELISA检测模式。Lai［38］等将噬菌体展示的OTA模拟表位应用于胶体金试纸条检测技术，可以在10min内检测10ppb OTA标准品，为建立一种安全且快速的真菌毒素检测方法提供了坚实基础。模拟表位有望在免疫学研究中成为天然真菌毒素的替代品，解决毒素标准品来源受限的问题，并且对建立真菌毒素的无毒检测体系意义重大。各种真菌毒素，如 DON［39］、OTA［40］、ZEN［41］等，模拟表位已通过淘选噬菌体展示肽库得到验证，然而其氨基酸序列并无显著同源性，这为真菌毒素模拟表位基序的进一步研究带来了困难。此外，展示在噬菌体表面的多肽因噬菌体自身生物活性的影响，其稳定性受到一定限制。因此噬菌体展示模拟表位在进入应用阶段之前，还存在一些尚待解决的问题。

3.2 抗独特型抗体

抗独特型抗体是针对抗体可变区的抗原决定簇(独特型)产生的特异性抗体。抗独特型抗体在机体内形成，当机体接受外来抗原刺激时，能识别外来抗原的淋巴细胞克隆首先被激活，产生针对外来抗原的抗体(Ab1)，随后能识别某一个克隆独特型决定簇的第2个克隆被激活，产生抗独特型抗体(Ab2)，依次类推还可以有第3个(Ab3)，第4个(Ab4)……这些克隆相互制约，相互连锁，形成一个闭合型、多层次级联网络［42］。抗独特型抗体应用于真菌毒素检测具有以下优点:实现相似结构靶标物的多残留检测;提高小分子免疫分析的灵敏度;生产无毒试剂盒［43］。Chu［44］等用单克隆抗体免疫新西兰白兔，得到针对伏马菌素B1(FMB1)的抗独特型抗体(Ab2)。通过鉴定Ab2的生物学活性，发现Ab2可作为FMB1及其他毒素检测分析的新一代抗原。因此抗独特型抗体可以替代毒素标准品在免疫检测中使用，避免了剧毒物质对检测人员的健康威胁，而且省去了将毒素半抗原与大分子蛋白质偶联这一步骤即可作为安全有效的免疫抗原。此外，针对其他真菌毒素如T－2毒素［45］、黄曲霉毒素［46］等无毒检测方法已建立。但是，抗独特型抗体并没有真正在真菌毒素免疫检测中得以应用。其主要原因是抗独特型抗体制备难度大，首先必须得到单克隆抗体，再经免疫之后筛选可以用于建立检测技术所需的抗独特型抗体难度较高，其成本甚至高于毒素标准品。最新研究成果表明，能否获得具有模拟抗原特性的抗独特型抗体，免疫原为关键所在。2011年，林超［47］等利用酶切纯化的F(ab’)2片段作为免疫原制备抗大田软海绵酸单抗独特型抗体，消除针对Fc片段的抗体，获得更好的免疫效果。如果将抗独特型抗体与基因重组抗体技术相结合，建立基于某种真菌毒素的抗独特型抗体库，便可以大大提高抗独特型抗体的筛选效率，并且能够有效地降低生产成本，为其在食品安全检测领域的应用提供技术支持。

4 小结

越来越多的新型检测元件已应用于真菌毒素检测体系，他们有各自的优缺点。单链抗体和单域抗体利用其分子量低、特异性高、抗原性低、易表达、利于在组织中渗透和扩散等优势，在新型抗体的研究领域发展迅速。但是大多数单链抗体的亲和力不如单克隆抗体，而且表达产物易形成无活性的包涵体。将单链抗体与分子伴侣和折叠酶共表达，或者采用优化表达条件，更换表达载体或表达系统等方法可以提高表达产物的可溶性。单域抗体就没有这一限制，即使表达出包涵体也容易复性。此外利用体外定向进化、基因突变等分子改造技术提高重组抗体的亲和力被证实是可行的。双特异性抗体因其具有多价抗体的性质可实现多种真菌毒素的同时检测，有其独特的应用价值，但是有关报道很少，相关技术还有待更深入地研究。相较于重组类抗体，分子印迹聚合物以其较高的耐受性、制备方法简便、能重复使用等特点受到越来越多的关注。然而由于真菌毒素价格高、毒性强，制备相应的分子印迹聚合物不仅成本高而且存在危险。如果将分子印迹技术与抗体技术结合，即可制备一种超越MIP的新型材料，使其既能用化学方法合成、可以反复使用、稳定性高，又具有与抗体相似的亲和力及特异性。还有一些检测元件旨在代替价格高昂、且危害检测人员身体健康的真菌毒素标准品。已有不少研究证明噬菌体展示模拟表位可以代替真菌毒素建立无毒ELISA检测体系。但必须指出，噬菌体展示肽不稳定、易降解的缺点不可避免地限制了其作为检测元件的应用范围。早在上世纪90年代已有人指出基于真菌毒素的抗独特型抗体可以替代毒素标准品在免疫检测中使用，但其制备难度大、成本高，不能大规模投入生产。将抗独特型抗体与基因重组抗体技术相结合有望在未来解决这一难题。

不论任何一种新型检测材料，除了具备免疫检测元件所必须的敏感性和特异性等基本条件以外，还应该具有比传统元件更优越的性能。目前人们所发现的新型检测材料仍处于探索阶段，还有待更多实验的考证。随着技术的进步，笔者相信在不久的将来，会有更多的新型检测元件在真菌毒素免疫分析中广泛使用。

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