耐药性结核快速诊断的研究进展

2013-04-06王明芹综述许卓文审校

河北医科大学学报 2013年6期

关键词：密码子抗酸噬菌体

王明芹（综述），许卓文（审校）

（1.武警河北总队医院门诊部，河北石家庄050081；2.河北医科大学期刊社临床荟萃编辑部，河北石家庄050017）

·综述·

耐药性结核快速诊断的研究进展

王明芹（综述）1，许卓文（审校）2

（1.武警河北总队医院门诊部，河北石家庄050081；2.河北医科大学期刊社临床荟萃编辑部，河北石家庄050017）

结核；抗药性；诊断技术和方法；综述文献

2007年世界卫生组织统计初治肺结核患者中，耐多药结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDRTB）占2.9％，复治患者中，MDR-TB占15.3％，耐药与既往治疗密切相关，任意耐药的比例可能要高出未治疗患者4倍，MDR-TB可能要高出10倍。全球每年新出现30～60万MDR-TB患者，其中24％在中国［1］。我国卫生部2010年4～7月组织全国31省、自治区、直辖市开展的第5次结核病流行病学调查也显示，我国肺结核患者耐多药率为6.8％，根据本次调查估算的我国现有的患者数，MDR-TB患者为33.9万，广泛耐药患者为10.5万，与其他国家相比仍十分严重［2］。MDR-TB的产生直接影响到化疗的失败，MDR-TB已经成为了结核病防治中的一大难题，现将耐药结核的定义、快速诊断的研究进展综述如下。

1 耐药结核的定义

全国多耐药结核病学术会议（1997年9月15—18日厦门）将MDR-TB定义为对异烟肼（H）、利福平（R）、比嗪酰胺（Z）、乙胺丁醇（E）、链霉素（S）5种主要抗结核药中任何2种及2种以上产生耐药者。考虑到耐HR在临床上的重要性，建议单独统计至少已经耐HR的情况。过去对MDR-TB的译名也比较混乱，有“多种耐药结核病”、“多重耐药结核病”等，经会议讨论，认为“耐多药结核病”一词比较贴切，其他相关名词统一为“耐多药结核分枝杆菌”、“耐多药菌株”、“耐多药病例”等。自1998年始，《中华结核和呼吸杂志》统一采用上述名词［3］。

2 显微镜观察药物敏感性检测（m icroscopic observation drug susceptib ility，MODS）技术

传统的结核菌耐药检测方法需时较久，普通的培养加药敏试验需要2个月时间，远不能满足诊治的需求，检测患者结核菌的耐药谱是治疗的必要条件，早期得到耐药信息对治疗更有意义。MODS是近几年发展起来的一种新的结核病病原学诊断方法，此方法2000年由Cavieds建立，根据结核分枝杆菌在液体培养基上形成特征性索状结构的特性，将痰、胸腔积液、脑脊液标本直接接种在液体培养基中，一般采用24孔细胞培养板，先在24孔细胞培养板内加入MODS培养基，然后取标本重悬液接种于培养板中，每个样本设阴性对照（液体培养基）、阳性对照（MTU标准菌株H37Rv）。标本孔再分别加入异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇等抗结核药，经37℃、10％CO2的培养箱进行培养。每天观察1次。在倒置显微镜下观察索状生长情况，若试验孔出现结核分枝杆菌特征性的索状结构即取此部分培养物进行抗酸染色鉴定，若抗酸染色发现抗酸杆菌则判定为MODS培养阳性，说明结核菌在有抗结核药存在的情况下还能生长，视为有耐药性，若接种40d后仍未观察到结核分枝杆菌特征性的索状结构出现则判定为阴性［4］。此方法具有快速、敏感、检测成本低的优势，不需要特殊仪器，操作安全，对预防耐药结核菌的传播、防止实验室工作人员的感染具有重要意义，正在被国内逐渐认识并应用。但此法的缺点是观察时间长了会导致观察者视觉疲劳，

还有临床常见的2种非结核分枝杆菌——耻垢分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌亦具有索状生长特征，陆俊梅等［5］对MODS培养基进行了改良，在培养基中加入了对硝基苯磺酸，若对照孔有明显索结构细菌状生长，硝基苯磺酸含药孔有细菌生长，则说明标本中有非结核分枝杆菌，若对照孔内有细菌生长，但无索状结构，判断为污染。若对照孔有明显索状结构细菌生长，加药孔内无索状结构生长则判定为该菌株对该药物敏感，反之，则判定该菌株对该药物耐药。黄自坤等［4］对264例肺结核临床疑似患者的痰标本和20例肺结核病患者的痰标本分别采用抗酸染色法、罗氏培养基（L-J）培养法和MODS技术进行结核分枝杆菌的检测。结果3种方法检测20例非结核病患者痰标本结果均阴性；在264例肺结核临床疑似患者的痰标本中，3种方法的阳性率分别为抗酸染色法28.8％、L-J培养法36.0％、MODS技术的阳性检出率42.8％，其中在102例抗酸染色和（或）LJ培养阳性的痰标本中，MODS检出97例（95.1％），在162例抗酸染色和L-J培养均为阴性的标本中，MODS阳性16例；若以临床诊断为标准，3种方法敏感度和特异度分别为MODS 63.4％和97.8％、L-J培养法54.3％和100％、抗酸染色法43.3％和100％，MODS的阳性检出中位时间为10d，明显短于L-J培养的25d。认为MODS技术与传统病原学检测方法相比，具有敏感度高、检出时间短的优势，适用于结核病的临床快速诊断。儿童结核往往症状不典型，痰标本留取困难，在抗酸染色阴性的患儿标本中，用MODS技术检测胃抽吸物、鼻咽抽吸物和粪便标本同样可以获得快速、高效的检测结果［6］。陈俊林等［7］应用MODS技术分离到32株耐左氧氟沙星的耐药结核分枝杆菌，再经过基因测序，32株均有21位密码子精氨酸-脯氨酸（CGA-CCA）突变和95位密码子丝氨酸-苏氨酸（AGC-ACC）突变，还有94位密码子天冬氨酸-组氨酸（GAC-CAC）、天冬氨酸-甘氨酸（GAC-GGC）、天冬氨酸-丙氨酸（GAC-GCC）、丝氨酸-天冬酰胺（GAC-AAC）突变，90位密码子天冬氨酸-甘氨酸（GAC-GGC）、GAC-TAC突变和91位密码子TCGCCG突变。其中，MODS技术选择出耐药分枝杆菌，DNA测序锁定突变位点。

3 BACTEC MGIT 960培养系统

BACTECMGIT 960是新一代产品，具有快速分离培养结核分枝杆菌和其他分枝杆菌的优势［8］，基本原理是在培养瓶的底部树脂中包被有对培养基中的氧有高度敏感的荧光指示剂，此指示剂在有氧气存在时被抑制，当结核分枝杆菌生长使氧气消耗尽时，荧光显示剂被激活而发出荧光，检测仪测试荧光强度，并判定结果。仪器每小时自动检测培养基内细菌对氧消耗所致荧光强度的变化，将测到的荧光强度以生长单位形式报告标本生长情况［8］。此方法比较传统的培养法操作简便，培养阳性率高于L-J法，缺点是无法观察菌落，污染率略高于L-J法，产品依赖进口（美国BD公司产品），价格较贵。陈小蓉等［9］用BACTEC MGIT 960培养系统和L-J法检测了179例标本（178份痰，1份颈淋巴结穿刺物），BACTEC MGIT 960培养系统阳性标本培养时间9.5d，药敏所需时间6.7d，L-J法为31.7d和28.0d（P＜0.01）。但2种方法的药敏结果差异无统计学意义。

4 噬菌体生物扩增（phage amp lified biologically assay，PhaB）法

分枝杆菌噬菌体是一种专门寄生于分枝杆菌的DNA病毒，具有严格的宿主特异性，并且只能感染活菌，分枝杆菌感染噬菌体后被裂解，释放出子代噬菌体，子代噬菌体又可以感染随后加入的指示细胞（耻垢分枝杆菌），如指示细胞被裂解，就会在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑，没有感染结核分枝杆菌的噬菌体则被其后加入的噬菌体杀灭剂灭活，已进入感染细菌的噬菌体不受影响，根据噬菌斑的有无和多少可以判断是否为结核分枝杆菌［10］。从标本采集到判读结果只需18～24h，此法敏感度高，如痰涂片抗酸染色需＞5 000条/mL结核菌才能查到阳性，而PhaB法＞100条/mL就能查到；特异度达99％以上，仅对结核分枝杆菌敏感，而对非结核分枝杆菌不敏感；此外，其检测不需昂贵的仪器，试剂盒中含有全部检测试剂，结果用肉眼即可判读，特别适合涂片阴性、培养阳性的患者，被认为是开创了结核分枝杆菌微生物检测的新纪元。冯爽等［11］将135例临床确诊为结核病的患者标本（痰、胸腔积液、肺泡灌洗液、脑脊液）和排除结核病患者的67例上述标本同时做了PhaB法、BACTEC MGIT培养法、涂片法，并对3种方法进行了比较，3种方法的检出率分别为PhaB法48.2％（65/135），涂片法28.2％（38/135），BACTEC MGIT培养44.4％（60/135），PhaB法高于涂片法（P＜0.05）。此法可以检测胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、尿液、脊髓等多种标本；可用于结核病的试验诊断、抗结核治疗效果的评价、初诊患者的鉴别诊断以及对人类免疫缺陷病毒感染高危人群的鉴别诊断。

5 聚合酶链式反应-单链构象多态（polym erasechain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）

PCR-SSCP技术能检测结核分枝杆菌分离株的多种耐药遗传标志，结核杆菌的耐异烟肼、利福平和乙胺丁醇主要与过氧化氢酶编码的katG基因、aphC启动子、inhA操纵子、kas A基因有关，乙胺丁醇耐药与embA、B、C基因有关［12］，有的甚至katG基因缺失，正常情况下，利福平与RNA聚合酶B亚基（rpoB）特异性结合，阻断RNA的合成而起到抑制细菌生长的作用。基因突变后rpoB亚基构象会发生改变，从而降低与利福平的亲和力。快速检测出这些基因是否突变，对临床判断是否耐药将具有重大意义。PCR-SSCP原理是根据单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，就会影响其空间构象，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中受阻大小不同，因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以非常敏锐地将构象有差异的分子分离开，PCR-SSCP比PCR更为简便、快速、灵敏，近几年被大量应用。

6 限制性片段长度多态性聚合酶链反应（polymerase china reation-restriction fragment length polymorphyism，PCR-RFLP）

PCR-RFLP也是在PCR基础上发展起来的，DNA碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或消失，利用这一酶切性质的改变，PCR特异扩增含碱基置换的这段DNA，经某一限制酶切割，再在利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较确定是否变异。如耐乙胺丁醇菌株就存在多位点的突变（以306，328，406，497位4个密码子多见），导致2个以上不同的氨基酸被置换而耐药，embB基因（尤其是306位密码子）突变是结核菌耐乙胺丁醇产生的主要原因［13-15］。贺红艳等［16］对确诊为结核的50株结核菌进行了PCRRFLP分析，结果只有5株为敏感株，45株异烟肼耐药株，其中9株对异烟肼单耐药，余45株为多耐药，经PCR-RFLP分析，5株敏感菌与H37Rv标准株轻质凝胶电泳条带一致，45株耐药株中，有1株被消化成4个片段；又将在PCR-RFLP分析中的异常泳动带的突变标本，进行DNA测序，其katG基因315位氨基酸密码子第2位碱基发生点突变，由丝氨酸突变为苏氨酸，这就是基因的点突变。目前我国应用此种方法的实验室很多。

生物学技术的发展促进了耐药结核的实验室诊断，有些是2项或几项技术联合应用，如PCR联合其他技术，耐药性结核杆菌的检出联合基因测试，不仅找到了耐药性菌株，也揭示了耐药性产生的机制，为结核患者的早期治疗提供了有利保证，但我国结核病防治工作仍然任重而道远，需要长期不懈的努力，新的技术需要不断开发，并应用于临床。

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