利用家蚕杆状病毒da26 基因融合表达L-天冬酰胺酶成熟肽

费建明 孔 莉 施国方 占鹏飞 吴 岩 白雪川 王文兵

(1浙江省湖州市农业科学研究院，浙江湖州 313000;2江苏大学生命科学研究院，江苏镇江 212013)

L－天冬酰胺酶是一种酰胺基水解的酶类药物，广泛应用于儿童急性淋巴细胞白血病治疗［1］，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效［2］。目前，L－天冬酰胺酶的生产大多采用以大肠杆菌为宿主的基因工程菌，表达产物主要位于细胞周质，用破碎细胞壁的方法纯化不仅步骤繁琐，还易导致蛋白污染［3］。费建明等［4］曾利用多角体融合表达了L－天冬酰胺酶，结果表明融合表达的基因产物具有活性，但对多角体的形成有一定影响。da26 基因编码杆状病毒的一种包膜蛋白，可以吸附于多角体的外膜上。将L－天冬酰胺酶的成熟肽序列asp(s)与da26融合表达，可以通过超声裂解和差速离心法将外源蛋白分离纯化［5－6］。本实验通过此方法与多角体融合表达的方法作比较，分析较优的表达形式，促进我国历史悠久的蚕桑业向更高层次发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大肠杆菌DH5α、pFastbacdual 载体、DH 10BacTM、BmN 细胞，由江苏大学生命科学研究院医学组实验室保存。SmaⅠ、XbaⅠ、SphⅠ等限制性内切酶，T4 DNA 连接酶、质粒柱抽试剂盒、胶回收试剂盒等购自TaKaRa 公司;TC－100 培养基、FBS 等购自Hy-Clone 公司。PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 目的基因的克隆及序列测定 根据Gen-Bank 中家蚕杆状病毒da26 序列，设计da26 引物，在上游引物 P1:TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCAACG 的5'端引进SmaⅠ酶切位点;在下游引物P2:GCTCTAGAGCAATAGGCGTTAATATCACTTTG 的5'端引进XbaⅠ酶切位点(下划线表示酶切位点，以下相同)。根据大肠杆菌JM109 基因组DNA 序列中L－天冬酰胺酶成熟区的DNA 片段，设计大肠杆菌引物，在上游引物P3:GCTCTAGAGCCCATCACCATCACCATCAC 的5'端引进XbaⅠ酶切位点;在下游引物P4:ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT 的5'端引进SphⅠ酶切位点。PCR 扩增的da26 和asp(s)产物分别用XbaⅠ单酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收酶切产物并作连接，得到Da26-asp(s)连接产物。用Da26-asp(s)连接产物做模板，da26上游引物 P1:TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCACACG，asp(s)下游引物P4:ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT 再作PCR 扩增。电泳回收后与T 载体连接并转化大肠杆菌。质粒抽提等基因操作参照文献［4］的方法进行。经酶切鉴定阳性的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.2 转移载体pFastdual-polh-da26-asp(s)以及穿梭载体的构建 用SmaⅠ和SphⅠ分别双酶切测序正确的Da26-asp(s)重组质粒获得Da26-asp(s)片段，同样酶切本研究组先前构建的含polh 基因(置于polh 启动子下)的pFastdual-polh 重组质粒，琼脂糖凝胶电泳回收后连接转化，将片段克隆至载体的p10 启动子下，得到重组转移质粒pFastdual-polhda26-asp(s)。将构建好的转移载体pFastdual-polhda26-asp(s)转化为DH10BacTM，涂布于含有Kan(50 μg/mL)、Gen(7 μg/mL)、Tet(10 μg/mL)、Xgal(1 mg/mL)和IPTG(0.8 mg/mL)的LB 固体培养基上。48 h 后挑取白色菌落接种于LB 培养液中，12～14 h 后提取重组DNA。用pUC/M13 引物(M13 Forward:5'-GTTTTCCCAGTCACG AC－3'，Reverse:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')PCR 鉴定正确后，得到重组Bac-polh-da26-asp(s)。

1.2.3 Bm-Bac-polh-da26-asp(s)DNA 转染Bm 细胞 将生长良好的BmN 细胞接种35 mm 细胞培养皿中，27 ℃培养过夜后更换无血清培养液，将提取的重组Bac-polh-da26-asp(s)DNA 在脂质体介导下转染家蚕BmN 细胞，2 h 后加入含有胎牛血清的培养基，继续培养并观察细胞感染症状。至症状明显时，收集细胞培养液，对正常细胞进行复感染，获得重组病毒。将收集的重组病毒大量感染细胞，观察到细胞内有多角体产生时，收集细胞用于L－天冬酰胺酶的活性分析。

1.2.4 L－天冬酰胺酶活性分析 以奈氏试剂检测L－天冬酰胺酶的活性。将已知浓度的硫酸铵作为标准样品浓度，绘制标准曲线，同时为排除杆状病毒自身可能的影响，以野生型BmNPV 作阴性对照。将上述感染后收集的细胞悬浮于2 mL PBS 中，置于冰上超声波破碎，强度为70 Hz，每超声15 s，于冰水中静置15 s，反复20 次，超声结束后进行蛋白含量测定，将各样品的浓度调整一致后置于4 ℃备用。L－天冬酰胺酶活性检测参照文献［4］的方法。

2 结果与分析

2.1 目的片段的克隆及重组转移载体的鉴定

Da26-asp(s)的连接产物经PCR 扩增后，片段大小与预期的一致(图1)。将重组得到的质粒pFastdual-polh-da26-asp(s)用SmaⅠ和XbaⅠ双酶切，得到约1 800 bp 插入片段，其大小与da26 加上His 标签，加上TEV 酶酶切位点，再加上asp(s)对应的核苷酸序列一致。结果表明重组转移载体pFastdual-polh-da26-asp(s)构建成功(图2)。

图1 Da26-asp(s)的连接产物PCR 扩增产物

图2 重组转移载体pFastdual-polh-da26-asp(s)的双酶切鉴定

2.2 重组病毒感染家蚕细胞

用BmN、重组病毒Bacdual-polh-da26-asp(s)、重组病毒BacHTB-his-asp(本研究组先前构建)分别感染家蚕细胞，72 h 后观察细胞感染及多角体的产生情况。BmNPV 感染家蚕细胞产生的多角体数量较多，重组病毒Bacdual-polh-da26-asp(s)感染的多角体产生数量较少，重组病毒BacHTB-his-asp 不产生多角体(图3)

2.3 L－天冬酰胺酶活性分析

根据硫酸铵的浓度制出标准曲线，计算出在家蚕细胞BmNPV 中表达的融合蛋白Da26-asp(s)的天冬酰胺酶活性为2 279.87 U/mg，比His 标签融合的天冬酰胺酶活性(2 800.00 U/mg)略低(图4)。

图3 不同病毒感染家蚕细胞多角体的生成(200 倍)

图4 BmNPV 表达的L-天冬酰胺酶活性比较

3 讨论

利用杆状病毒da26 基因产物的性质将其与L－天冬酰胺酶的成熟肽序列融合表达，这种表达的融合产物具有一定的活性，但没有以His 标签融合表达的L－天冬酰胺酶活性高，其原因可能与蛋白的融合方式有关，也有可能是不同的启动子效率造成的。因His 融合表达是在多角体基因(polh)启动子调控下，其启动活性高于另一个杆状病毒晚期基因的启动子p10。但为便于感染和纯化，作者利用双启动子，一个表达外源蛋白，一个表达多角体，这样设计使病毒粒子可以包被于多角体中，便于生产上接种家蚕虫体，同时表达产物能吸附于多角体上，易于纯化。但由于表达量略有下降，表达形式还需进一步改进。

［1］吴晓英，吴振强，林影，等.L－天冬酰胺酶的研究进展［J］.广东药学，2003，6(13):42－44.

［2］刘红，潘红春.抗癌药物L－天冬酰胺酶及其研究进展［J］.四川轻化工学院学报，2000，2(13):31－36.

［3］王利群，黄达明，赵希岳，等.胞外表达L－天冬酰胺酶发酵条件的研究［J］.安徽农业科学，2009，37(33):16 280－16 281.

［4］费建明，吴岩，占鹏飞，等.家蚕BmNPV 多角体蛋白与大肠杆菌L－天冬酰胺酶Ⅱ的融合表达［J］.中国蚕业，2011，32(2):29－31.

［5］Imai N，Kurihara M，Matsumoto S，et al.Bombyx mori nucleopolyhedrovirus orf8 encodes a nucleic acid binding protein that colocalizes with IE1 during infection［J］.Archives of Virology，2004，149(8):1 581－1 594.

［6］Song J，Oh S J，Kang W H，et al.Robot－assisted gastrectomy with lymph node dissection for gastric cancer:lessons learned froman initial 100 consecutive procedures［J］.Ann Surg，2009，249(6):927－932.