HPLC法测定冠心伏寒颗粒中淫羊藿苷的含量

贾艾玲，董金香，姚 雪，王 睿，邱智东

(长春中医药大学，长春 130117)

冠心病是常见的心血管疾病，发病率高。临床发现，部分冠心病患者伴有“先天伏寒”症状[1-4]。虽然治疗冠心病的药物众多，但是针对兼具“先天伏寒”症状的患者有效药物较少。冠心伏寒颗粒是长春中医药大学黄永生教授基于已故国医大师任继学教授的“男女媾精，阳气不足，寒伏于内”病因学说和20多年治疗胸痹证的临床实践总结出来的用于治疗冠心病的经验方剂，由淫羊藿、红参等10味中药经提取纯化而制成，为国家重大新药创制项目。该药在活血化瘀的同时，还能温补肾阳，与其他的药物相比，针对性更强。淫羊藿为方中的君药，具有温肾壮阳，祛风湿, 强筋骨的功效[5-6]。采用高效液相色谱法对制剂中的淫羊藿苷进行定量研究，可为评价冠心伏寒颗粒质量提供方法。

1 仪器与试药

LC-10AT型高效液相色谱仪(日本岛津)；SPD-10Avp紫外检测器;浙大N 2000色谱工作站；TP-150超声波清洗机(天鹏电子新技术有限公司)；EL-204梅特勒-托利多电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。淫羊藿苷对照品(批号111699-200501)，购自中国药品生物制品检定所；冠心伏寒颗粒(批号:20120701，20120702，20120703，均由吉林康奈尔药业有限公司生产提供)；乙腈为色谱纯，购自北京博伦凯鑫科技有限公司;水为娃哈哈纯净水；其他化学试剂均为分析纯，购自吉林省金鑫化玻有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(28∶72)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长270 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL，理论塔板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1 500[7-8]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇溶解制成每1 mL含0.040 16 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取粉末(过60目筛)约0.5 g,精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率150 W,频率40 kHz)30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过，取续滤液，过微孔滤膜(0.45 μm)，即得。

2.2.3 阴性对照试验 按处方比例称取除淫羊藿以外的其余药材按照制备工艺依法制得缺淫羊藿的阴性对照样品。按2.2.2项下方法操作，制备淫羊藿阴性对照溶液,按照相应的色谱条件进行试验，所得阴性对照色谱图中，在与样品色谱图中淫羊藿苷峰相同保留时间处无任何色谱峰出现，表明处方中其他药材对淫羊藿苷的含量测定无影响。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下淫羊藿苷对照品溶液2、5、10、15、20 μL，注入液相色谱仪，依法测定，以峰面积积分值Y为纵坐标，以淫羊藿苷对照品进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归。淫羊藿苷的线性回归方程为:Y=44 233X-2 430.2(r=0.999 9)，表明淫羊藿苷在0.080 32-0.803 2 μg范围内,对照品溶液进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下淫羊藿苷对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，测得淫羊藿苷峰面积的RSD为1.65%，表明仪器的精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 分别精密吸取同一淫羊藿苷对照品溶液和供试品溶液各10 μL,分别于0、3、6、12、18、24 h注入高效液相色谱仪，测得供试品溶液及对照品溶液中淫羊藿苷峰面积的RSD分别为0.91%和1.89%，均<3.00%，表明对照品溶液及供试品溶液在24 h内均较稳定。

2.3.4 重现性试验 精密称取同一批次的样品(批号:20120701)6分，分别按“2.2.1”项下方法制备，分别精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，测得样品中淫羊藿苷的含量为1.237 0 mg，RSD为2.31%，表明该方法的重现性良好。

2.3.5 加样回收率试验 取已知含量的样品(批号:20120701)6分，每分0.25 g，精密称定。分别精密加入淫羊藿苷对照品溶液(浓度为0.321 3 mg/mL)1 mL，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算回收率为99.05%，RSD为1.29%，表明本品回收率较好。

2.3.6 样品含量测定 按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，平行测定3批冠心伏寒颗粒中淫羊藿苷的含量。结果显示，3批样品中淫羊藿苷含量分别为1.237 0 mg/g，1.189 2 mg/g，1.345 3mg/g。

2.3.7 3批药材含量测定 按《中国药典》2010年版一部淫羊藿项下的含量测定方法[7]，对投料的3批不同厂家淫羊藿药材(分别购自吉林省宏检医药药材有限公司、吉林省同仁大药房有限公司、吉林大药房药业股份有限公司)进行测定。结果，淫羊藿药材中淫羊藿苷含量分别为0.55%、0.53%、0.57%。表明3批投料淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量基本稳定，均符合《中国药典》2010年版一部淫羊藿项下规定。

3 讨论

3.1 流动相的优选 本实验曾对多种流动相进行考察，选择不同比例甲醇-水体系、甲醇-水-冰醋酸体系，发现色谱柱压力较高，杂质峰较多，峰形较差；改用乙腈-水体系后，淫羊藿苷色谱峰与其余杂质峰得到基线分离，峰形好，分离效果较为理想，因此，选择乙腈-水(28∶72)作为测定制剂中淫羊藿苷的流动相。

3.2 供试品溶液处理方法的优选 分别采用水、乙醇、稀乙醇、70%乙醇、甲醇5种提取溶剂处理供试品，结果表明，甲醇的提取效率最高，能最大限度的提取淫羊藿苷，且在文中所列液相色谱方法下可获得较为理想的分离效果。

3.3 制剂中淫羊藿苷含量限度的规定 中药淫羊藿品种来源复杂，在前期工艺研究中发现，市售的淫羊藿药材很多达不到《中国药典》2010年版规定。淫羊藿苷不得低于0.5%的要求，药材质量之间差异较大，因此，在制药企业投料之前需严格控制药材的质量，才能保证制剂的有效性。依据3批样品的平均含量，下浮20%，制定冠心伏寒颗粒的含量限度，规定本品含有淫羊藿苷不得低于1.0 mg/g。

3.4 结论 本实验在课题组对制剂提取工艺的研究基础上，建立了以高效液相色谱法测定冠心伏寒颗粒中淫羊藿苷含量的方法，经方法学验证，该方法的精密度、稳定性、重现性及回收率均符合要求，适合测定淫羊藿苷的含量，可为冠心伏寒颗粒的质量标准研究提供科学依据。

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