骨组织工程支架材料应用于大段骨缺损的实验研究进展

李东亚，郑 欣，陈一心

由损伤、感染、骨肿瘤术后等原因造成的大段骨缺损，其临床治疗方法包括骨延长术［1］、带血管蒂骨移植术［2］等，其中最佳治疗方法是骨移植，但由于自体骨移植供骨量有限且存在取骨区感染风险，而同种异体骨移植存在传染疾病的可能［3］，使得骨移植的应用受到限制。1995年 Crane等［4］提出骨组织工程概念，即应用工程学和生命科学的手段，将种子细胞种植到天然或人工合成的支架材料、细胞外基质上，然后将复合细胞的支架材料植入到骨缺损部位，在支架材料降解的同时，种子细胞增殖分化为成骨细胞，从而修复骨缺损。骨组织工程的3个关键要素是支架材料、种子细胞和生物活性因子。根据其来源的不同，骨组织工程支架材料主要分为人工合成无机材料、人工合成高分子材料和天然生物衍生材料3种。近年来骨组织工程支架材料的设计及制作技术发展迅速，本文就几种典型的支架材料应用于大段骨缺损的实验研究进展作一综述。

1 磷酸三钙 (tricalcium phosphate，TCP)

TCP的化学式为 Ca3(PO4)2，按结构分为高温相(α-TCP)和低温相(β-TCP)。β-TCP具有良好的生物相容性、骨引导作用和可降解性能，利于宿主的细胞和血管长入材料，在形成新骨的同时材料被逐步降解吸收，从而完成新骨的“爬行替代”过程，在大段骨缺损的修复中主要应用β-TCP。由于其缺乏骨诱导性，多采用具有骨诱导性的自体骨髓［5］、重组人骨形态发生蛋白(recombinant human bone morphogenetic protein，rhBMP)［6］等与其复合使用。Erbe 等［5］认为，由于自体骨移植时供血延迟可造成移植骨死亡，而β-TCP多孔生物陶瓷的多孔结构更利于血管化和细胞的营养供应，β-TCP/自体骨髓复合材料在促进新生骨供血方面比自体松质骨移植效果更好。Busuttil等［7］比较了 rhBMP-7/β-TCP复合材料和单独应用β-TCP材料修复兔颅骨骨缺损时的成骨能力。在材料置入骨缺损3个月后处死动物，组织学检查发现rhBMP-7/β-TCP复合材料组再生骨量占总缺损骨量的平均百分比为(29.41±6.25)%，远高于单独应用β-TCP材料组;力学性能检测发现，rhBMP-7/β-TCP复合材料组远较单独应用β-TCP材料组好，其中应用复合材料的某些个体，其新生骨力学性能甚至与正常骨相当，可见rhBMP-7/β-TCP复合材料组在修复骨缺损时更有优势。但亦有生长因子与β-TCP复合后，不能表现出良好的修复骨缺损能力，如转化生长因子 β3(transforming growth factor-β3 ，TGF-β3)等［8］。

提高TCP的骨诱导性不仅可通过复合细胞因子实现，还可通过联合应用种子细胞实现。E等［6］研究了复合鼠脂肪基质细胞(rat-adipose-derived stromal cells，rASCs)和rhBMP-2的β-TCP复合材料在骨组织工程的应用。他们评估复合材料修复骨缺损能力的指标包括，细胞附着能力、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、钙磷含量、基因表达等。分组实验的研究结果表明，β-TCP可促进鼠脂肪基质细胞向成骨细胞表型分化，材料中复合的生物活性因子rhBMP-2能显著增加培养在β-TCP上的rASCs中钙磷含量，碱性磷酸酶活性，骨钙素mRNA水平、I型胶原含量等，因此rASCs/rhBMP-2/β-TCP复合材料修复骨缺损时再生骨量最多，修复骨缺损具有更大的优势。

尽管目前修复骨缺损的动物实验中多应用β-TCP，然而也有学者认为［9］，在复合材料中α-TCP较β-TCP有更好的成骨能力。他们在比较 α-TCP、β-TCP、羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)等3种支架材料修复 Wistar大鼠直径5mm的颅骨骨缺损时，将3种材料复合辛伐他汀，辛伐他汀可以刺激rhBMP-2表达，micro-CT检查结果表明3种支架材料复合辛伐他汀组均较不复合组有更好的成骨效果，而复合辛伐他汀同时也影响了α-TCP和β-TCP的降解，α-TCP较β-TCP具有更高的降解率而骨再生更多，复合辛伐他汀的α-TCP更加增强了这种优势。

2 羟基磷灰石 (hydroxyapatite，HA)

HA是最稳定的磷酸钙形式之一，其化学式为 Ca10(PO4)6(OH)2，是常见的生物活性材料。HA用于骨组织工程修复大段骨缺损的优点是较好的生物相容性、骨传导性、可降解性。有学者［10］在动物实验中发现HA修复骨缺损的效果与自体骨移植相当，不过HA缺点是很脆，拉伸性很差。HA作为骨组织工程支架材料应该具备合适的孔隙率以利于新的骨组织生成及机体微环境交换，具备适宜的表面以利于细胞附着、迁移、扩散，因此多孔结构的支架材料应用较多。Heo等［11］应用冷冻干燥技术，制作新型纳米级(HA颗粒直径20～90纳米)和微米级(HA颗粒直径20～80μm)的HA/聚己内酯复合支架;尽管两种材料均为高度多孔材料，具有相似的孔径和孔隙率(72% ～73%)，然而其颗粒直径的显著不同造成显著差异的机械性能。两者弹性模量分别是(3.187±0.06)兆帕和(1.345±0.05)兆帕，前者的弹性模量明显大于后者，表现出更好的机械性能。Heo等［12］进一步应用电子扫描显微镜、组织染色等比较上述纳米级和微米级HA/聚己内酯复合支架的成骨效果，发现前者较后者更易黏附和增殖间充质干细胞，骨缺损处有更多的钙和碱性磷酸酶，可见纳米级较微米级HA支架修复骨缺损时更有优势。目前已有临床应用的报道证实，纳米级HA/胶原复合材料应用于临床口腔科治疗牙周骨缺损时较开放皮瓣清创术效果更好。

与其他生物材料不同，纳米级HA复合金属材料还具有较好的抗菌功能［13-14］。Sahithi等［14］通过扫描电镜、红外光谱和X射线衍射技术合成和表征纳米级HA和纳米级HA/Cu复合材料，并在两种材料上接种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，比较菌株数后发现纳米级HA/Cu复合材料具有较好的抗菌能力，而且复合聚乙二醇400的纳米级HA/Cu材料表现出对革兰氏阳性菌更好的抗菌效果，该研究还证实了聚乙二醇400-纳米级HA/Cu复合材料不具有细胞毒性。

3 聚己内酯 (polycaprolactone，PCL)

聚己内酯属半结体聚酯，易溶于有机溶剂，具有良好的生物相容性，稳定的物理和机械属性［15］，是一种被广泛关注的高分子合成材料。但是聚己内酯在机械强度、生物活性及骨诱导能力方面仍有不足［16］，骨组织工程中亦多应用其复合材料。Reichert等［17］比较了PCL-TCP和HA-SF(silk fibroin，SF)与自体骨髓移植治疗羊胫骨大段骨缺损时的成骨效果;术后12周，X射线，扭转测试和定量计算机断层扫描分析表明，骨缺损在自体骨髓移植组完全桥接，在PCL-TCP组部分桥接，而HA-SF组仅有少量骨生成;生物力学测试显示，PCL-TCP组和自体骨髓移植组的新生骨扭矩/刚度值之间无显著差异;他们认为结合成骨细胞或生长因子的PCLTCP材料将表现出更好的修复骨缺损能力。Cai等［18］将人类胚胎干细胞来源的间充质干细胞种植在L-乳酸-聚己内酯复合材料上，修复兔胫骨骨缺损，X线和组织学检测证实了支架内外有较多新骨生成。Laird等［19］研究了烧结牛松质骨化学渗透PCL后的机械性能，机械压缩试验表明烧结牛松质骨化学渗透PCL后弹性模量增加，PCL可优化烧结牛松质骨在骨移植中的应用。

4 壳聚糖 (chitosan，CTS)

壳聚糖属于天然生物衍生物，化学名为(1，4)聚-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，可通过化学法和酶解法获得，是甲壳素脱乙酰基的产物，而甲壳素是甲壳类动物外骨骼的主要组成部分。因而壳聚糖除了具有较好的骨传导性，还有良好的生物相容性，但是其机械强度较差［20］。由于碳纳米管具有高杨氏模量、高抗拉强度和高断裂伸长率［21］，人们研制出了碳纳米管复合壳聚糖天然聚合物材料以增加机械强度［22］，当0.8%的碳纳米管均匀地分散在整个CTS矩阵时，复合材料较单纯壳聚糖的拉伸模量和机械强度提高了约93%和99%。为进一步提高壳聚糖的力学性能和生物相容性，Kavya等［20］将壳聚糖与硫酸软骨素及纳米级二氧化硅复合，复合支架材料表现出丰富的孔隙率、生物降解性、机械完整性、矿化和蛋白质可吸附性;而且涂布纤维蛋白的该纳米支架能更好地黏附细胞，这种新型复合材料支架较为适合应用于骨组织工程。动物实验研究表明［18］，可注射性纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合支架修复大段骨缺损效果很好，他们在新西兰大白兔左股骨髁处制作直径6mm，长10mm的大段骨缺损，术后12周，应用纳米羟基磷灰石/壳聚糖组的骨缺损完全愈合，而单纯应用壳聚糖组的骨缺损愈合尚不完全。

为了从基因水平探讨壳聚糖单体影响成骨的过程，Ganno等［23］利用低浓度壳聚糖单体培养成骨细胞。壳聚糖单体诱导丝裂原活化蛋白激酶及碱性磷酸酶基因等4个信号转导基因表达的增加。低浓度的壳聚糖单体直接影响成骨细胞内的信号转导mRNA水平，调节成骨细胞的活性。鉴于生物活性因子骨形态发生蛋白(BMP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等在成骨中具有重要作用，可将该类因子与壳聚糖联合应用，Si等［24］应用基因工程技术，将转染了VEGF的骨髓基质干细胞种植在纳米级HA/羟甲基壳聚糖复合支架上，用于修复兔桡骨骨缺损;术后12周，复合材料组已经有较多新骨生成;术后24周，新骨生成较12周时明显增多，同时复合材料仅有较少的残存，大部分已降解。虽然应用基因工程，壳聚糖复合材料修复骨缺损效果较好，但尚未得到临床应用。

5 丝素蛋白(silk fibroin，SF) 丝素蛋白是一种可降解的生物大分子，其化学结构和力学性能可调，骨再生能力良好，可作为理想的骨组织工程支架材料［25］。丝素蛋白较高分子聚合材料的优点包括:具有水溶性使得制作支架材料过程中可避免使用有毒的有机溶剂，同时具有可控的生物降解性有利于骨细胞顺利长入支架材料［26］。但其机械性能不佳，常选用具备较高机械性能的材料与其复合应用于骨组织工程。

鉴于生物活性玻璃具有较好的机械性能，Wu［27］等比较了多孔生物活性玻璃/丝素蛋白材料、普通生物活性玻璃/丝素蛋白材料与单纯丝素蛋白修复骨缺损时的成骨能力，实验中骨缺损动物模型为免疫缺陷小鼠3mm直径全层颅骨骨缺损。3种材料具有相似的孔隙率(约75%)，术后8周处死小鼠，缺损处行micro-CT扫描以及组织学分析，结果表明多孔生物活性玻璃/丝素蛋白材料的新生骨量较其他两组多，他们认为多孔生物活性玻璃/丝素蛋白材料非常适合做组织工程生物活性支架。该试验同时反映了单纯使用丝素蛋白修复骨缺损的效果有限。但并不是所有的丝素蛋白复合材料的成骨能力都是良好的，Kweon等［28］在比较纳米级HA复合丝素蛋白与单纯纳米级HA修复兔直径8mm颅骨骨缺损的成骨能力，发现术后8周应用组织计量学测得单纯纳米级羟基磷灰石的骨再生比率(40.16±8.27)%远远高于空白对照组(25.66±10.98)%和复合材料组(16.62±3.05)%，这表明复合材料的应用仍有很多需要改进的地方，如复合材料的孔径及孔隙率的控制等。

孔隙结构的优化可显著改善丝素蛋白支架材料的成骨效果，Zhang等［29］应用冷冻干燥技术，制作了4组孔径在50～300μm之间的三维丝素蛋白支架，并将转染BMP-7基因的人骨髓基质干细胞培养在这4组支架，然后置入免疫抑制小鼠的骨缺损处，观察其成骨反应。他们应用细胞活力比色法、碱性磷酸酶检测和逆转录-聚合酶链反应分析孔径对细胞的生长和成骨细胞分化的影响。结果表明，转染BMP7的骨髓基质干细胞在孔径为100～300μm的三维丝素蛋白支架上生长良好，有较多新生骨组织出现，可见优化孔隙结构的三维丝素蛋白支架可以调节BMP7转染的骨髓基质干细胞在骨形成过程中的生物活性。有报道指出［30］，碱性水解法获得的微米级丝素纤维(10～600μm)，其抗压强度可达13兆帕，而且这种方法获得的丝素材料表面粗糙、多孔、高硬度，适合于骨髓基质干细胞向骨样组织分化及骨标记基因表达，同时该材料在体内实验表现出较低的免疫反应。

虽然系统的骨组织工程学研究历史不长，但骨组织工程支架材料的制备方法和制备技术都已有了长足进步，如纳米技术、基因工程等，多种新型复合骨组织工程支架材料在动物试验中修复大段骨缺损的效果得到肯定。但是目前对细胞与骨组织工程支架材料的相互作用研究还停留在细胞水平。随着骨组织工程研究的不断深入，相信骨组织工程支架材料能更加完善地结合种子细胞、生物活性因子以高效地修复大段骨缺损。在不久的将来，骨组织工程支架定会在大段骨缺损的临床治疗中发挥重要作用。

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