HO／CO在甲醛炎性痛大鼠脊髓痛传导及痛觉过敏产生中的作用*

李慧娜，郭莉华，李清君，刘 蕾

血红素氧合酶 （heme oxygenase，HO）是生成内源性一氧化碳（carbon monoxide，CO）最主要的限速酶，可催化亚铁血红素（heme）产生CO。HO-1为HO的一个亚型，可被多种因素所诱导表达。我室的研究已证实，甲醛炎性痛可诱导脊髓HO-1表达增多［1］，但HO／CO在甲醛炎性痛大鼠脊髓痛觉过敏形成中发挥什么作用并不清楚。

已有一些HO／CO在疼痛模型中发挥促痛作用的相关报道。Li等［2］研究发现，大鼠单侧后爪切开或结扎L5或L6脊神经根后，出现同侧后爪异常性疼痛和热痛觉过敏，给大鼠应用HO的抑制剂锌原卟啉（zinc protoporphyrin，Znpp）后能够剂量依赖性的减轻疼痛程度，但对痛觉过敏的影响不明显。另有研究发现，HO的抑制剂可以降低由鞘内注射N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑 （a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate，AMPA）及神经递质谷氨酸所诱导的疼痛相关行为［3］，这些研究均证实，HO／CO系统在不同的疼痛模型中均发挥促痛作用。但迄今为止，有关HO／CO在脊髓热痛觉过敏和机械性痛觉过敏产生中的作用尚无定论。

因此，本实验通过甲醛炎性痛大鼠鞘内注射HO的抑制剂Znpp，观察其对甲醛炎性痛大鼠的自发痛反应以及对热和机械性痛阈的影响，通过正常大鼠鞘内注射 HO的激动剂氯化高铁血红素（hemin），观察其对正常大鼠热和机械痛阈的影响，探讨 HO／CO在脊髓痛觉传导以及热和机械性痛觉过敏形成中的作用。

1 材料与方法

1．1 实验动物和分组

实验选用健康雄性SD大鼠50只，由河北医科大学实验动物中心提供，体重（250±20）g。将动物随机分为2大组。

第1组又分为6个亚组（n＝5），分别为正常对照组（control组）、甲醛组（F 24 h组）、甲醛 ＋溶剂DMSO组（DMSO组）、甲醛 ＋Znpp 50μg组（Znpp 50 μg组）、甲醛＋Znpp 100μg组（Znpp 100μg组）和甲醛＋Znpp 300μg组（Znpp 300μg组）。DMSO组和各剂量Znpp组预先鞘内注射相应的溶剂DMSO或Znpp溶液（半量），30 min后足底注射甲醛并进行痛反应评分，注射甲醛后24 h再次鞘内注射溶剂DSMO或Znpp溶液（半量），30 min后测定热辐射缩足反射潜伏期和机械刺激缩足反射阈值。

第2组又分为4个亚组（n＝5），分别为正常对照组（control组）、Hemin溶剂 NaOH组、Hemin 187．5 μg组和Hemin 375μg组。溶剂NaOH组和Hemin各剂量组于正常大鼠鞘内注射相应的溶剂或激动剂后30 min测定热辐射缩足反射潜伏期和机械刺激缩足反射阈值。

1．2 主要仪器及试剂

Von Frey刺激纤维和BME-410C型全自动热痛刺激仪均为中国医学科学院生物医学工程研究所产品；Znpp和Hemin均为美国 Sigma公司产品；Znpp溶剂二甲基亚枫（DMSO）为德国 Serva公司产品，Hemin溶剂氢氧化钠（NaOH）为天津市东方化工厂产品，甲醛溶液为石家庄有机化工厂产品。

1．3 鞘内注射方法

参照Mestre等［4］所建立的方法进行。大鼠吸入乙醚麻醉，用26．5-G连有聚乙烯管的针头经腰5（L5）和腰 6（L6）椎间隙行椎管穿刺。以穿刺针内有脑脊液流出或动物出现突然的侧向甩尾运动，作为穿刺成功的标志。鞘内注射采用微量进样器进行，将微量进样器针头插入导管内，缓慢推注药物，推注过程约1 min。在此过程中未观察到动物出现痛苦或疼痛的迹象。

1．4 甲醛炎性痛模型的建立及痛反应评分方法

给大鼠右后足底中心皮下注射5%甲醛溶液0．2 ml复制疼痛模型。甲醛溶液注射后，立即将动物放入一树脂玻璃箱中进行痛反应评分，观察时间为1 h。痛反应评分采用 Dubbisson与 Dennis［5］建立的加权积分法（weighted scores），评分分为4级：3分：舔、咬和剧烈抖动注射足；2分：注射足高抬，走动时不着台面，完全不能持重；1分：注射足不完全着地，不持重或轻微持重或行走时出现跛行；0分：自由行走，跛行不明显。0分表示无明显疼痛反应，痛反应评分越高，表明疼痛越剧烈。对以上各级每5 min的评分做加权平均，作为甲醛炎性痛的痛反应评分。痛反应评分加权平均 ＝∑pt／300，其中p为大鼠伤害性痛行为反应的评分，t为该行为反应的持续时间（s）。

1．5 热辐射缩足反射潜伏期测定

将动物置于15 cm×15 cm×20 cm有机玻璃罩内，底为厚约2 mm的玻璃板，将热刺激仪的光源照射在大鼠足底部位，并调节照射光的直径至 5 mm大小，电压设置为 10 V，记录从开始照射到大鼠抬足所需时间作为热辐射缩足反射潜伏期，潜伏期显著缩短被认为有热痛觉过敏发生。大鼠足底同一点照射5次，每次照射之间间隔10 min，取平均值作为热辐射缩足潜伏期。两侧足底照射之间间隔5 min。如果照射时间大于30 s大鼠仍无反应则停止照射，以免造成足底组织过度热损伤。

1．6 机械刺激缩足反射阈值测定

将动物置于与上述相同的有机玻璃罩内，底为用金属丝制成的网格垫，使用不同粗细的 von Frey纤维（刺激强度分别为 0．09 g，0．18 g，0．28 g，0．52 g，1．12 g，3．8 g，5．5 g，7．7 g，10．4 g，18．2 g，44 g和61 g），通过金属网格刺激大鼠足底，每个强度反复刺激10次，每次刺激之间间隔 3～5 s，出现缩足反射5次以上的刺激强度即为大鼠对机械刺激的反应阈值。

1．7 统计学处理

数据应用SPSS 13．0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（¯x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较采用 t检验。

2 结果

2．1 鞘内注射 Znpp对甲醛炎性痛大鼠自发痛反应的影响

注射甲醛后，动物即出现舔、咬、摇动注射侧脚掌等疼痛相关表现。30 min后注射部位出现红、肿等组织炎症表现。甲醛炎性痛大鼠鞘内注射溶剂DMSO后，甲醛诱导的大鼠自发疼痛反应评分无明显改变。与甲醛组相比，预先鞘内注射 HO抑制剂Znpp 50μg、100μg或 300μg，均可明显抑制甲醛诱导的伤害性反应，表现为大鼠疼痛反应评分明显降低，且随Znpp剂量的增大，其对大鼠痛行为的抑制作用也越明显（图1）。

Fig．1 Effect of Znpp on the spontaneous pain in one hour following subcutaneous formalin injection into the plantar surface of the right hindpaw．The weighted pain score of Dubuisson and Dennis was used for the pain rating DMSO：Formalin＋DMSO group Znpp 50μg：Formalin＋Znpp 50μg group；Znpp 100μg：Formalin＋Znpp 100μg group Znpp 300μg：Formalin＋Znpp 300μg group；DMSO：Dimethyl sulfoxide；Znpp：Zinc protoporphyrim*P＜0．05，**P＜0．01 vs formalin group

2．2 鞘内注射Znpp和Hemin对甲醛炎性痛大鼠及正常大鼠热辐射缩足潜伏期的影响

实验中观察到，与control组比较，足底注射甲醛24 h后，注射足热辐射缩足潜伏期明显延长，非注射足热辐射缩足潜伏期明显缩短，说明注射足出现了热痛觉麻痹，而非注射足出现了热痛觉过敏。与单纯甲醛组比较，甲醛＋DSMO组或甲醛＋Znpp各剂量组动物注射足热辐射缩足潜伏期均无明显改变；而在非注射足，甲醛＋DSMO组热辐射缩足潜伏期与甲醛组比较无明显改变，甲醛＋Znpp各剂量组动物热辐射缩足潜伏期均明显高于甲醛组，并且Znpp的剂量越大，热辐射缩足潜伏期增加越明显（图2）。

Fig．2 Changes of thermal withdrawal latency after intrathecal injection of Znpp in rats with formalin immflammtory pain**P＜0．01 vs control；＃＃P＜0．01 vs F 24 h group DMSD：Dimethyl sulfoxide；Znpp：Zinc protoprphyrin

与正常对照组大鼠相比，Hemin溶剂NaOH组动物双足热辐射缩足潜伏期均无明显改变。不同剂量激动剂Hemin组动物，双足热辐射缩足潜伏期均明显缩短，双足之间无明显差异，不同剂量组之间也无明显差别（图3）。

Fig．3 Changes of thermal withdrawal latency after intrathecal injection of different dose Hemin to normal rat．There is no obviously difference between Hemin 187．5μg group and Hemin 375μg group in thermal withdrawal latency*P＜0．05 vs control group

2．3 鞘内注射Znpp和Hemin对甲醛炎性痛大鼠及正常大鼠机械刺激缩足反射阈值的影响

实验中观察到，与control组比较，足底注射甲醛24 h后，注射足机械刺激缩足反射阈值明显延长，非注射足机械刺激缩足反射阈值明显缩短，说明注射足出现了机械性痛觉麻痹，而非注射足出现了机械性痛觉过敏。与单纯甲醛组相比，甲醛＋Znpp各剂量组以及甲醛＋DSMO组大鼠注射足机械刺激缩足反射阈值均无明显改变；而在非注射足，甲醛＋DSMO组与单纯甲醛组比较，机械刺激缩足反射阈值无明显改变，而甲醛＋Znpp各剂量组大鼠机械刺激缩足反射阈值则明显升高，且Znpp的剂量越大，机械刺激缩足反射阈值增高越明显（图4）。

Fig．4 Changes of mechanical withdrawal threshold after intrathecal injection of Znpp in rats with formalin immflammtory pain DMSO：Dimethyl sulfoxide；Znpp：Zinc protoporphyrin**P＜0．01 vs control；＃＃P＜0．01 vs F24 h group

本实验还观察到，正常大鼠鞘内注射Hemin溶剂NaOH后，与正常对照组相比，双足机械刺激缩足反射阈值均无明显改变。正常大鼠鞘内注射HO激动剂Hemin溶液后，双足机械刺激缩足反射阈值均明显降低，双足之间无明显差异，不同剂量组之间也无明显差异（图5）。

Fig．5 Changes of mechanical withdrawal threshold following intrathecal injection of different dose Hemin to normal rat．There is no obviously difference between Hemin 187．5μg group and Hemin 375μg group in mechanical withdrawal threshold**P＜0．01 vs control group

3 讨论

我们在以往的实验中观察到，甲醛炎性痛可诱导大鼠脊髓后角HO-1表达增多，且以甲醛注射后24 h时表达增高最为显著［1］，但 HO-1表达增多及CO产生增多在脊髓的痛觉传递和痛觉过敏中发挥什么作用，目前尚不清楚。

我室以往的研究发现，足底注射甲醛24 h时，大鼠的热辐射缩足潜伏期及机械刺激缩足反射阈值变化最为显著，表明此时大鼠的热和机械性痛觉过敏最为明显。因此，本实验选择甲醛注射后24 h作为时间点，观察鞘内注射HO抑制剂Znpp对甲醛炎性痛大鼠热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值的影响，同时观察了鞘内注射HO激动剂Hemin对正常大鼠热辐射缩足潜伏期和机械刺激缩足反射阈值的影响，以探讨HO／CO在脊髓痛觉传递以及热和机械痛觉过敏产生中的作用。

结果显示，预先鞘内注射不同剂量Znpp，可明显降低注射甲醛所引起的大鼠自发痛反应程度，提示HO／CO参与了脊髓痛感觉传递过程，并在此过程中发挥促痛作用。

预先鞘内注射不同剂量Znpp，可使甲醛炎性痛大鼠的非注射足热辐射缩足潜伏期明显延长，机械刺激缩足反射阈值也明显升高，且Znpp剂量越大，这种作用越明显。表明Znpp在抑制脊髓HO活性及其诱导的CO产生的同时，减轻了甲醛炎性痛大鼠热和机械性痛觉过敏程度，提示HO／CO参与并促进了甲醛炎性痛大鼠热和机械性痛觉过敏的产生。

正常大鼠鞘内注射HO的激动剂Hemin后，双侧足热辐射缩足潜伏期明显缩短，机械刺激缩足反射阈值也明显降低，表明鞘内注射HO的激动剂Hemin可诱导正常大鼠产生热和机械性痛觉过敏，这一结果进一步证实，HO／CO系统的激活在脊髓敏感化和脊髓的痛觉过敏产生机制中发挥重要作用。

本研究还发现，足底注射甲醛溶液后，注射足出现了感觉减退或感觉麻痹现象，可能是由于甲醛作为化学性刺激物，引起外周组织及其神经末梢伤害性感受器损伤所致。

有关HO／CO系统的激活在脊髓敏感化和脊髓的痛觉过敏产生中的作用机制尚不十分清楚，根据现有的研究资料分析，可能是多种途径共同参与的结果。

有研究证实［6］，CO释放分子（CORM-2）通过激活HO-1和蛋白激酶 B（Akt）诱导低氧诱导因子（HIF-1α）的高表达，而磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）的抑制剂使CORM-2诱导的HIF-1α表达显著减少，提示HO／CO可通过 PI3K／Akt途径发挥其生物学效应。而有研究者发现，PI3K／Akt途径是伤害性疼痛产生的重要参与者。Pereira等［7］通过脚爪注射胰岛素制备大鼠炎症和疼痛模型，发现预先鞘内注射或脑室内注射PI3k抑制剂，可剂量依赖性减轻胰岛素诱导的大鼠脚爪疼痛程度。因此，我们推测HO／CO可能通过激活PI3K／Akt而发挥其促进中枢敏感化的作用。

HO诱导的内源性CO以旁分泌或自分泌的方式作用于邻近细胞，与可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）结合，并激活该酶，活化的sGC使cGMP水平迅速升高，而cGMP则以细胞内第二信使的身份发挥其生物学效应。有研究发现［8］在小鼠福尔马林炎性痛模型中，鞘内注射cGMP可增加小鼠舔足次数并促进其机械痛觉过敏，提示cGMP在脊髓痛觉过敏产生中发挥重要作用。因此，我们推测HO／CO也可能通过sGC-cGMP信号转导途径导致了中枢敏感化的形成。

越来越多的资料显示，在多种病理过程中，HO／CO系统和NOS／NO系统之间存在着密切联系。已有一些研究证实，HO／CO系统对NOS／NO系统的激活具有促进作用［9］。有大量研究结果证明，NOS／NO在脊髓痛觉敏化过程中发挥重要作用。Roh等［10］发现，鞘内注射σ-1受体激动剂可诱导小鼠发生机械性痛觉过敏和热痛觉过敏，但预先鞘内注射nNOS抑制剂，则可抑制该机械性痛觉过敏和热痛觉过敏的产生，提示NOS／NO系统在脊髓具有促进痛觉过敏形成的作用。因此推测，炎性痛时脊髓HO／CO激活也可能通过NOS／NO参与痛觉过敏的形成过程。

综上所述，鞘内给予HO的抑制剂Znpp可以抑制足底注射甲醛诱导的自发痛反应及其痛觉过敏，正常大鼠鞘内给予HO的激动剂Hemin则可诱导其产生痛觉过敏。表明HO／CO系统在脊髓伤害性信息的传导和痛觉过敏的产生过程中发挥重要作用。

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