异氟烷预处理对大鼠离体心脏保存效果的影响

李 镭，梁智星，梁法禹

缺血预处理（ischemic preconditioning，IP）已经在动物试验中得到验证［1］，但临床实践中很难充分应用。异氟烷作为常用的全身麻醉药已经在临床上得到普遍应用。本文就异氟烷预处理后心肌功能的变化进行探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂、仪器和动物 异氟烷（isoflurane）：山东科源制药有限公司（山东省医药工业研究所制药厂）；肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒：长春汇力生物技术有限公司生产；K-H缓冲液（Krebs-Henseleit buffer solution，KHB）、心脏保存液为HTK液：北京荣生医药科技发展中心；SD大鼠由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 离体大鼠心脏模型的建立 成年SD大鼠36只，雌雄各半，体重270 g～320 g（6周龄～8周龄），腹腔注射肝素（3 mg／kg）和戊巴比妥钠（65 mg／kg），仰卧位，开胸，于升主动脉和头臂干近端切断主动脉和上腔静脉，切断下腔静脉，肺动脉分叉前切断肺动脉，取出心脏，迅速放入0℃～4℃K-H缓冲液中，冲洗出心脏内残留血液，并移至Langendorff灌注装置上，经主动脉灌注K-H液，根据大鼠正常生理血压范围，设定灌注压为80 mm Hg～100 mm Hg，灌注液温度维持35℃～37℃，鼠心周围温度在34℃～36℃。整个灌注期间用95%O2和5%CO2混合气体饱和K-H液。肺动脉根部切开，充分引流冠状静脉回流液。经预实验掌握切取技术后，正式实验时开胸取心至灌注开始控制在1 min内完成。稳定3 min～5 min后切开心耳，经左心房、二尖瓣，将连接测压导管的球囊送入左心室，测压导管的另一端连接多导生理记录仪。向心室球囊内缓慢注射适量生理盐水（55μL～70μL），使左室舒张末压维持在10 mmHg～12 mm-Hg。平衡20 min后，心脏搏动达到稳定状态，测定血流动力学基础值并留取冠脉流出液标本。

1.2.2 灌注及低温保存方法（HTK保存液） 连续灌注K-H液平衡30 min后，经主动脉根部单次灌注4℃的HTK液，灌注剂量为30 m L／kg，灌注时间为2 min，心脏表面同时降温，心脏停搏后置于HTK液中保存。在4℃条件下分组保存4 h、6 h和8 h，保存期间不进行重复灌注。保存结束后重新将鼠心移至Langendorff装置上灌注K-H液，逐渐复温至37℃，使心脏复跳，并持续灌注30 min，测定血流动力学指标并留取冠脉流出液测量心肌酶。

1.3 选择心脏的标准 离体心脏经Langendorff装置平衡灌注15 min后，心率（HR）＜200次／min，左室收缩压（LVSP）＜75 mm Hg，早搏＞2次／min，舍弃不用。4 h组、6 h组中共有3只大鼠退出实验，后续试验补齐实验例数。

1.4 实验分组 采用完全随机分组，根据造模前是否使用异氟烷预处理，将36只大鼠分为两组，每组18只。实验组：造模前2 d，每天腹腔注射异氟烷原液3 m L／kg。对照组：造模前2 d，每天腹腔注射生理盐水3 m L／kg。之后再根据保存时间，各分为4 h组、6 h组、8 h组，每组6只。保存后6 h组1只大鼠，8 h组2只大鼠离体心不复跳，退出实验，后续补齐例数。

1.5 统计学处理 所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS18.0统计软件处理，各项心功能指标以复灌稳定后测得与实验开始基础值的百分比表示。采用方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 心脏血流动力学指标的影响 随着离体心脏保存时间的增长，心功能指标恢复率（复灌稳定后测得指标与实验开始基础值之比，以百分比表示）逐渐降低。实验组4 h、6 h与对照组比较，心功能指标恢复率差异无统计学意义（P＞0.05），8 h实验组与对照组比较，心功能各项指标恢复率差异有统计学意义（P＜0.05）。提示异氟烷预处理可以改善离体心脏低温保存效果，但在冷保存6 h以内无明显差异。详见表1。

表1 不同保存时间再灌注30 min后心功能指标恢复率（±s） %

表1 不同保存时间再灌注30 min后心功能指标恢复率（±s） %

注：LVEDP为左心室舒张末压；LVDP为左心室舒张压；LVSP为左心室收缩压；＋dp／dtmax为左心室最大压力上升速率；-dp／dtmax为左心室最大压力下降速率。与对照组同时间比较，1）P＜0.05

组别 n LVEDP LVDP LVSP ＋dp／dtmax -dp／dtmax实验组 4 h 6 89.20±3.12 86.70±16.41 84.74±4.60 90.03±13.45 90.73±14.51 6 h 6 80.45±3.58 84.34±12.71 80.22±5.51 86.31±11.75 84.76±12.22 8 h 6 61.42±4.221） 66.89±15.121） 75.01±4.811） 71.63±9.851） 68.83±10.141）对照组 4 h 6 88.45±4.45 87.41±12.61 86.40±3.31 91.21±11.32 91.05±12.52 6 h 6 81.44±4.24 86.35±14.71 82.21±3.13 88.64±13.35 87.85±10.06 8 h 6 67.57±6.90 60.36±14.32 65.22±2.61 67.30±11.43 72.70±12.75

2.2 冠脉流出液中CK、LDH含量的影响 离体心脏保存前取各组平衡灌注冠脉流出液基础值，各组间差异无统计学意义。随着离体心保存时间的延长，各组心肌酶CK、LDH均有不同程度升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组4 h、6 h与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），实验组8 h与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

3 讨 论

缺血预处理是在首次一定时间缺血后对再次缺血的耐受力提高现象，这一现象在临床上心肌缺血及缺血再灌注方面具有实用价值，但人工造模生成缺血在临床上无法进行，应用药物提高缺血阈值（药物预处理，APC）即成为临床医生的期望，故本实验对此进行探讨。

缺血预处理的保护作用可分为两个时相，即早期保护（early phaseof protection，EP），指心肌在预处理后其抗损伤的能力立即明显增强，约可持续1 h～3 h。二是延迟保护（delayed phase of protection，DP），指预处理后24 h再次出现的抗损伤能力，这是心肌的亚急性适应保护反应，出现后约可持续2 d～3 d。上述二者之间不存在连续过程。即预处理后马上出现抗损伤能力，2 h～4 h后消失，24 h后又出现，持续2 d～3 d后消失。现有研究认为［2］，EP的抗损伤能力是激活机体现有的各种抗损伤效应子，因此出现快、持续时间短。而DP抗损伤能力是机体通过抗损伤基因的复制、转录、翻译产生新的抗损伤效应子，二者之间的中断过程就是新的抗损伤效因子的产生过程。因此，DP的起效慢、作用时间长。

EP减少心肌梗死面积的能力比DP强［3］。但DP不仅能减少心肌梗死面积，而且能抗心律失常［4］和心肌顿抑（Stuning）［5］。EP不能反复刺激出现［6］，即在长时间缺血再灌注前，不论给予多少次的预处理，其抗损伤能力不能加强，持续时间也不会延长。而DP可以反复刺激出现［7］，即在长时间缺血再灌注前24 h给予预处理产生抗损伤能力，2 d～3 d后再给予预处理，其抗损伤能力仍可出现。有资料表明反复DP处理可使心肌的抗损伤能力持续10 d［8］。因此，DP比EP有更广阔的临床应用前景。假设在供心保存前马上给予心脏预处理，其抗损伤能力仅能在术中体现，保存后没有体现。而在供心保存前24 h给予预处理，心肌的抗损伤能力在术中及整个供心保存期间均能体现。

吸入麻醉药是一类对心肌可以产生负性变力的药物，临床应用因其降低心肌耗氧量，从而对心肌有一定类似IP的保护作用［9，10］。本实验采用Langendorff立体心脏灌注模型，排除了神经、体液因素和心脏前、后负荷的影响。以目前临床常用吸入麻醉药-异氟烷进行心肌药物预处理，且在实验前24 h给药，使药物完全代谢，排除异氟烷本身直接的抗心肌缺血效应。更加确切了异氟烷的药物预处理的心肌保护作用。目前麻醉药物除应用于麻醉、疼痛治疗和ICU使用外，尚无其他的临床治疗作用，麻醉药物预处理的研究为麻醉药物的应用开辟了一个新的方向。

LVEDP、-dp／dtmax是反映出左心室舒张期顺应性及心肌保存后僵硬程度的指标之一，其中LVEDP在评价缺血再灌注损伤方面比LVDP更为敏感［11］，所以在低温保存供心后再灌注过程中，动态观察左室功能中加入LVDEP的变化用来判断心肌损伤程度。实验中，置入左心室的水囊体积恒定，因而水囊内的压力变化可以反映LVEDP的变化，测量出左心室的顺应性。本实验结果显示，低温保存8 h，各项心功能指标实验组较对照组均明显改善，但保存4 h与6 h实验组与对照组差异无统计学意义。8 h实验组复灌后心功能指标LVDP、LVSP、＋dp／dtmax明显好于对照组，表明异氟烷预处理可以提高收缩功能；LVEDP、-dp／dtmax上升程度8 h实验组低于对照组，表明异氟烷可以改善再灌注后心肌舒张功能，降低心肌僵硬程度。根据以上心功能指标可以看出异氟烷预处理可以提高低温保存8 h的离体心功能，但对于低温保存6 h以内离体心功能无明显影响。

因为再灌注损伤和细胞膜通透性增高，心肌中丰富的酶大量漏出，致使冠脉流出液中心肌酶浓度升高，酶学指标水平与细胞坏死量密切相关，从其水平有助于判断心肌细胞损伤程度［12］。本实验中，冷保存后心肌酶均有不同程度升高，且随时间延长，心肌酶升高越加明显。8 h实验组与对照组之间心肌酶CK、LDH升高程度差异有统计学意义，提示异氟烷可以减轻再灌注心肌细胞的损伤。

本实验结果提示异氟烷在8 h组具有心肌保护作用，这与冷保存离体心脏特点有关，相关文献指出［13］，冷保存8 h是心肌能量储存急剧下降，心功能显著减退的关键阶段，HTK液在6 h内心肌保护效果好，虽然各项试验指标有轻度下降，但差异无统计学意义，超过6 h保存效果下降明显。目前临床上常用的单次灌注低温保存是一种安全、简单而且经济的方法，国际公认此法保存心脏时限一般在4 h～5 h，但国外有报道，认为供体心脏保存8 h以上已经不再是心脏移植的禁忌证［14］，国内也报道了3例供心离体保存6 h～9 h后行心脏移植获得成功的病例［15］。而本实验异氟烷在心脏离体保存8 h中的心肌保护作用，恰好为超过一般保存时限的心脏移植提供了帮助，具有临床实践意义。

本实验未能对冷保存时间大于8 h进行观察，且对异氟烷具体预处理影响的具体机制还有待进一步研究。

本实验采用异氟烷预处理，实验组在缺血前采用腹腔注射实验剂量的异氟烷，经24 h取离体心脏进行冷保存后心功能指标恢复情况，通过测定心肌酶及心肌力学指标，评价异氟烷的作用效果，结果显示在腹腔预先注射异氟烷后，冷保存8 h心脏恢复较佳。

［1］ Murry CE，Jennings RB，Reimer KA，et al.Preconditioning with ischemia：A delay of lethal cell injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124-1136.

［2］ Foadoddini M，Esmailidehaj M，Mehrani H，et al.Pretreatment with hyperoxia reduces in vivo infarct size and cell death by apoptosis with an early and delayed phase of protection［J］.Eur J Car-diothorac Surg，2011，39（2）：233-240.

［3］ Cohen MV，Baines CP，Downey JM.Ischemic preconditioning：Fromadenosine receptor to KATPchannel［J］.Annu Rev Physiol，2000，62：79-109.

［4］ Roberto B.The late phase of preconditioning［J］.Circ Res，2000，87：972.

［5］ Tang XL，Qiu Y，Park SW，et al.Time course of late preconditioningagainst myocardial stunning in conscious pigs［J］.Circ Res，1996，79（3）：424-434.

［6］ Cohen MV，Yang XM，Downey JM.Conscious rabbits become tolerant tomultiple episodes of ischemic preconditioning［J］.Circ Res，1994，74：998-1004.

［7］ Dana A，Baxter GF，Walker JM，et al.Prolonging the delayed phase of myocardial protection：Repetitive adenosine A1receptoractivation maintains rabbit myocardium in a preconditioned state［J］.J Am Coll Cardiol，1998，31：1142-1149.

［8］ Baxter GF，Yellon DM.Time course of delayed myocardial protectionafter transient adenosine A1receptor activation in the rabbit［J］.J Cardiovasc Pharmacol，1997，29：631-638.

［9］ Bemard JM.Effects of sevoflurane and isoflurane on cadiac and coronary dynamics inchronically instrumented dogs［J］.Anesthesilogy，1990，72：659-662.

［10］ Navalija E，Fujita S，Kampine JP，et al.Sevoflurane mimics ischemic preconditioning effects on coronary flow and nitric oxide release in isolated hearts［J］.Anesthesilogy，1999，91：701.

［11］ Thomson DA，Waldron CB，Junl SM，et al.Analysis of left ventricular pressure during isovolumic relaxation in coronary artery disease［J］.Circulation，1982，65：690.

［12］ 叶任高.内科学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：301.

［13］ Cannon MB，Vine AJ，Kantor HL，et al.Warm and cold blood cardioplegia：Comparison of myocardial function and metabolism using SP magnetic resonance spectroswpy［J］.Circulation，1994，90（2）：329-338.

［14］ Hosseinzadeh T.Adverse effect of prearrest hypothermia in immature hearts：Rate versus duration of cooling ［J］.Ann Thorac Surg，1992，53（3）：464-471.

［15］ Lahorra JA，Torchiana DF，Tolis G，et al.Rapid cooling contracture with cold cardioplegia ［J］.Ann Thorac Surg，1997，63（5）：1353-1360.