侧脑室注射L-精氨酸对大鼠运动能力和下丘脑一氧化氮含量的影响*

薛金娟，刘鸿宇

（1.第四军医大学唐都医院放射科，陕西西安710038；2.中北大学运动医学研究所，山西太原030051）

运动尤其是大负荷运动可引起血液、骨骼肌、心肌、主动脉和胰腺中一氧化氮（nitric oxide，NO）合成增多。运动期间NO能够松驰血管平滑肌，增加血流量、降低运动期间骨骼肌的氧消耗、促进葡萄糖向骨骼肌细胞内转运，从而提高肌肉工作效率和机体运动能力。Shen等［1］认为运动训练能增加NOS的基因表达，并得出世界级水平运动员NO生成较高的判断。补充NO生成剂是否能够延缓疲劳成为运动生理学研究的热点。L-精氨酸（L-arginine，L-Arg）是人体自身可合成的半必需氨基酸，作为NO合成的唯一前体，参与了NO所有生理调节过程。在正常情况下，L-Arg通过饮食摄入和体内鸟氨酸合成即能满足人体需要，但在大负荷运动情况下L-Arg因过度消耗而严重缺乏，即体内L-Arg合成速度不能满足运动中消耗。同时，Huang等［2］研究发现口服L-Arg可降低力竭大鼠心肌、肝脏和肾脏中丙二醛的含量，通过NO的抗氧化性作用延长运动力竭时间，提高大鼠运动能力。Mcconell等［3］给运动员静脉注射 L-Arg（0.5 g／min，60 min）可增加运动期间腿部骨骼肌NO含量、四肢血流量和葡萄糖摄取量，从而提高运动成绩。上述研究表明口服、灌胃和静脉注射等方式补充L-Arg均能够提高运动能力并延缓疲劳发生。但目前L-Arg与运动能力的报道多侧重于骨骼肌和外周组织，对于脑组织等中枢神经系统的研究较少。早期Buchmann等［4］研究表明大鼠腹腔注射0.8 g／kg精氨酸后，脑组织中 L-Arg和瓜氨酸明显增加，表明外周补充L-Arg可通过血脑屏障进入脑组织，从而增加脑内含量。提示外周补充L-Arg对运动能力的影响可能与中枢调节有关。脑内直接补充L-Arg对大鼠运动能力的影响以及外周补充LArg的中枢机制，目前尚未见报道。本文通过侧脑室微注射方法直接改变脑内L-Arg含量，观察大鼠运动能力和一次性力竭后下丘脑及海马L-Arg代谢产物——硝酸根 ／亚硝酸根（NO3-／NO2-，NOx-）含量的改变，由此探讨L-Arg调节运动能力的可能中枢机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

清洁级成年雄性SD大鼠，体重230～250 g，由山西医科大学实验动物中心提供［许可证编号：SCXK（晋）2009-0001］，自由饮食，室温（24±2）℃。适应环境 7 d后，以10m／min，10 min／d的运动量进行为期3 d预运动，淘汰不擅长跑台运动的大鼠。随机分为（n＝11）：生理盐水＋运动至力竭组（对照组）；L-Arg＋运动至力竭组（L-Arg组）。

1.2 主要试剂与仪器

L-Arg（Sigma公司），NO试剂盒（南京建成生物工程研究所），FT-200动物跑台（成都泰盟科技有限公司），SP-752型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

1.3 行为学指标

采用旷场实验测定动物的自发活动和基本体能，通过记录3min内大鼠穿格次数、直立次数和修饰次数，间接反映大鼠对新环境的探究、兴奋性和适应能力。分别在手术前、手术恢复后和连续4 d注药结束后三个时间段进行旷场实验测试。

1.4 侧脑室微量注射

大鼠麻醉后，在脑立体定位仪引导下，向一侧侧脑室（坐标为：前卤-1.0mm，中线外侧 1.4 mm，硬脑膜下3.6mm）植入一带有内芯的不锈钢套管（直径0.9mm），用牙科水泥将其固定于颅骨。手术恢复后，用微量进样器插入套管内，于3 min内匀速注射完毕，留针2 min。对照组注射10μl生理盐水，LArg组注射 10μl L-Arg（500μg）。连续注药 4 d。

1.5 一次性跑台力竭模型

跑台测试在每天 8∶00～12∶00，室温（23±2）℃进行。第4次注药结束后，立刻以速度为18m／min，坡度为5°的运动强度进行一次性力竭测试，运动强度相当于最大摄氧量的66%，属于有氧运动，记录运动至力竭时间（T）并计算运动期间所做的总运动量（W）。大鼠运动能力由运动至力竭时间和运动期间所做总运动量来评定，总运动量计算公式如下：其中 W（kgm）为运动量；m（kg）为大鼠重量；v（m／min）为跑台速度 18 m／min；T（min）为运动至力竭时间；θ为跑台坡度。力竭标准为：大鼠不能坚持跑台运动，后肢随转动皮带拖欠达30 s，连续给予电或机械刺激1 min后无效。腹部与跑道面接触，呼吸幅度大。下跑台后反应迟钝，暂无逃避反应。

1.6 NO检测

力竭后从尾静脉取血0.5 ml，之后立刻断头取脑。制成1 mm厚的冰冻脑冠状切片，根据大鼠立体定向图谱，在解剖显微镜下用注射针头分别挖取两侧下丘脑（视交叉前缘至乳头体后缘）和海马，称重后以冷生理盐水作匀浆介质，研磨制成10%的组织匀浆。离心取上清液，-20℃保存，待测。亚硝酸根和硝酸根（NO3-／NO2-，NOx-）是 NO在体内的代谢产物，NOx-可准确代表NO水平，具体操作按NO试剂盒说明书（硝酸还原酶法）进行。血浆中NOx-含量用μmol／L表示，脑组织中检测每克蛋白中NOx-含量（μmol／g pro）。

1.7 统计学分析

数据用均数±标准差（±s）表示，统计处理用SPSS 17.0软件进行分析。旷场实验采用双因素重复方差分析，方差齐性时两两比较采用Tukey检验，不齐时采用Tamhane′s T2检验；两组之间的实验数据采用独立样本t检验进行分析，比较两组间均值的差异。

2 结果

2.1 手术及药物两因素对旷场行为的影响

双因素方差分析结果显示对照组与L-Arg组在手术前、手术恢复后及注药结束后大鼠穿格次数、直立次数、修饰时间均无明显变化，即手术和药物两因素对大鼠探究行为及兴奋性等自主行为无显著性影响（P＞0.05，表 1）。

Tab.1 Result of open-field test in different stage（±s，n＝11）

Tab.1 Result of open-field test in different stage（±s，n＝11）

Group Pre-operation After recovery After injectio n Wear case number Upright number Modification time（s）Wear case number Upright number Modification time（s）Wear case number Upright number Modification time（s ）Control 103.4±20.1 25.3±5.1 17.0±3.2 101.5±28.6 23.6±5.2 17.5±4.4 107.6±22.9 25.4±3.9 16.4±3.0 L-Arg 100.6±28.7 23.0±4.6 18.0±4.1 102.4±22.3 20.6±5.8 19.6±3.2 102.8±31.4 21.1±3.8 17.7±5.0

2.2 力竭时间和运动量

侧脑室注射L-Arg组运动至力竭时间（150.71±51.77）min与对照组（99.28±10.90）min相比明显增加（P＜0.05），升高幅度为 51.8%；L-Arg组运动量（64.19±23.20）kg m也显著高于对照组（42.77±4.80）kgm（P＜0.05），升高 50.08%（图 1）。

Fig.1 Effect of i.v.c.injection of L-arg on rat’s running in treadmill exercise

2.3 NO浓度变化

运动力竭后L-Arg组血浆中NOx-浓度为（64.04±13.84）μmol／L，对照组为（66.06±17.97）μmol／L，两组相比无显著性差别（P＞0.05）。L-Arg组下丘脑 NOx-浓度为（8.93±1.83）μmol／g pro，与对照组相比显著增加（P＜0.01）。两组海马NOx-浓度也无显著差异（P＞0.05，表 2）。

Tab.2 NOx-level of blood，hypothalamus and hippocampus in rats（±s，n＝11）

Tab.2 NOx-level of blood，hypothalamus and hippocampus in rats（±s，n＝11）

**P＜0.01 vs control group

Group Blood（μmol／L）Hypothalamus（μmol／g pro）Hippocampus（μmol／g pro ）Control 66.06±17.97 4.25±0.79 7.52±2.17 L-Arg 64.04±13.84 8.93±1.83**8.58±2.46

2.4 运动能力与脑内NOx-浓度的关系

大鼠总运动量与力竭状态下下丘脑NOx-浓度呈正相关性（P＜0.01，图2A）。大鼠运动期间总运动量与力竭状态下海马NOx-浓度无相关性（P＜0.01，图 2B）。

3 讨论

Fig.2 Correlation between NOx-concentration in hypothalamus or hippocampus and changes in the total workload till exhaustion（W）

L-Arg不仅能够产生NO，还能合成蛋白质，促进血氨进入尿素循环。为了避免L-Arg自身引起的外周效应，本文选择侧脑室直接注射方式。结果显示L-Arg组血浆中NO浓度与对照组相比无显著差别，表明侧脑室注射L-Arg不能引起运动应激状态下外周NO变化，排除了运动过程中外源性NO通过舒张血管增加血流量等方式来影响机体运动能力。研究表明侧脑室注射500μg L-Arg可以改变脑内NO含量及胃电活动，而250μg剂量不能产生相应效果［5］；Delwing等［6］可通过侧脑室注射 5μl，1.5 mmol／L L-Arg（即 1 306μg）建立“高精氨酸血症”疾病模型，而补充 5μl，0.5mmol／L L-Arg（即 436μg）无负面效应。所以本文选择侧脑室注射10μl，500μg L-Arg的适当剂量，既能够改变脑内NO含量又不至于引起高精氨酸症。

本文在手术前、手术恢复后和连续4 d注药后分别对大鼠进行旷场实验测试，结果显示三个时间段大鼠穿格次数和直立次数均无显著变化，表明手术和药物因素对大鼠自主运动能力及对兴奋性无明显影响；同时大鼠修饰时间也无显著变化，表明手术和药物因素对大鼠在新环境中的适应能力也无影响。以上表明侧脑室植入套管手术、连续4天注射L-Arg对大鼠运动行为无显著性影响，排除了手术和药物对运动效果的负面影响。

大量研究表明口服、灌胃和静脉注射等外周方式补充L-Arg有利于延缓疲劳的发生［2，3］。本研究发现侧脑室注射L-Arg明显延长运动至力竭时间（51.8%），增加总运动量（50.08%），提高大鼠运动能力，说明外周和中枢补充L-Arg都能够改善大鼠运动能力，延缓疲劳发生。Lacerda等［7］发现侧脑室注射NOS抑制剂L-NAME引起运动期间产热和散热平衡失调，导致体温在运动11 min后显著增高，从而诱导运动疲劳提前发生。与本文研究结果一致，进一步证明了中枢NO参与了运动能力的调节，补充L-Arg可能通过增加中枢NO水平来发挥作用。

下丘脑作为神经内分泌重要核团，参与了运动性疲劳的形成。Kima等［8］发现禁食应激后大鼠室旁核神经元型NOS表达增加，跑台训练能减少其含量，王晓东等［9］发现一次性力竭后大鼠下丘脑NO明显降低，可能由于运动期间NOS活性受到抑制或NO前体明显消耗所致。上述研究说明运动能够降低下丘脑NO含量。本文经侧脑室L-Arg预处理后，发现力竭后下丘脑NO含量增加，并且大鼠运动能力与力竭状态下下丘脑NOx-浓度呈正相关性。表明L-Arg可能通过下丘脑L-Arg-NO途径增加脑血流量和保护神经元活性，而延缓疲劳发生。本文经LArg连续4 d预处理后，发现力竭后海马NOx-含量无显著变化，并且大鼠运动能力与力竭状态下海马NOx-浓度无相关性。表明力竭运动中海马NO没有参与大鼠运动能力的调节，可能因为运动力竭时LArg作为NOS底物在海马脑区还处于饱和状态，根据酶促反应动力学，底物L-Arg饱和时NOS酶的活性中心就不再改变，暗示在运动期间海马L-Arg不缺乏。本文结果显示力竭后下丘脑NO含量增加，海马NO无显著变化。表明下丘脑可能是中枢NO参与运动能力调节最主要的脑区之一。侧脑室注射L-Arg可能只通过下丘脑L-Arg-NO途径提高大鼠运动能力，延缓疲劳发生。

中枢NO可影响急性力竭大鼠运动能力，侧脑室微量注射L-Arg增加大鼠下丘脑NO含量，延长运动至力竭时间，增加运动期间总运动量，从而提高大鼠运动能力。L-Arg可能通过下丘脑L-Arg-NO信号通路提高运动能力，延缓运动疲劳发生，下丘脑可能是中枢NO参与运动能力调节最主要的脑区之一。

［1］ Shen W，Zhang X，Zhao G，et al.Nitric oxide production and NO synthase gene expression contribute to vascular regulation during exercise［J］.Med Sci Sport Exerc，1995，27（8）：1125-1134.

［2］ Huang CC，Tsai SC，Lin W T.Potential ergogenic effects of L-arginine against oxidative and inflammatory stress induced by acute exercise in aging rats［J］.Exp Gerontol，2008，43（6）：571-577.

［3］ Mc Conell G K，Huynh N N，Lee-Young R S，et al.LArginine infusion increases glucose clearance during prolonged exercise in humans［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2006，290（1）：E60-66.

［4］ Buchmann I，Milakofsky L，Harris N，et al.Effect of arginine administration on plasma and brain levels of arginine and various related amino compounds in the rat［J］.Pharmacol，1996，53（3）：133-142.

［5］ 王光明，闰长栋，朱立言.侧脑室注射L-精氨酸对清醒大鼠胃运动及胃电的影响［J］.徐州医学院学报，2003，23（1）：17-20.

［6］ Delwing D，Delwing D，Bavaresco CS，etal.Protective effect of nitric oxide synthase inhibition or antioxidants on brain oxidative damage caused by intracerebroventricular arginine administration［J］.Brain Res，2008，1193：120-127.

［7］ Lacerda A C，Marubayashi U，Balthazar C H，et al.Evidence that brain nitric oxide inhibition increases metabolic cost of exercise，reducing running performance in rats［J］.Neurosci Lett，2006，393（2-3）：260-263.

［8］ Kima SS，Kima H，Lee SL，etal.Treadmillexercise suppresses food-deprivation-induced increase of nitric oxide synthase expression in rat paraventricular nucleus［J］.Neurosci Lett，2003，353（1）：41-44.

［9］ 王晓东，吴燕波，吴禅清，等.运动恢复期间大鼠不同脑组织中NO和MDA代谢水平的研究［J］.广州体育学院学报，2002，22（2）：31-33.