rhAng-1对局灶性脑缺血／再灌注大鼠血脑屏障血管内皮细胞间连接的影响*

于 航，贾庆波，薛一雪

（1.哈尔滨医科大学大庆校区基础医学院生理教研室，黑龙江大庆163319；2.哈尔滨医科大学附属第五医院胸外科，黑龙江大庆163319；3.中国医科大学基础医学院神经生物学教研室，辽宁沈阳110001）

急性脑梗死是目前严重威胁人类健康的疾病之一，脑缺血致脑细胞损伤。目前认为，急性脑梗死的最佳治疗是尽快溶栓。但溶栓治疗有可能导致脑缺血／再灌注损伤，容易引起脑水肿，甚至脑出血，其主要原因是由于血脑屏障（blood brain barrier，BBB）通透性增加。

BBB由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞、基底膜等成分组成，其中相邻内皮细胞间的连接，如紧密连接和粘附连接是保持血脑屏障完整性的重要功能单位，是决定血脑屏障通透性的主要因素，其在血管内皮细胞上的分布和／或表达水平影响紧密连接的开放或关闭。脑缺血及其再灌注引起的一系列神经炎症反应、兴奋性谷氨酸中毒、细胞内Ca2＋超载、氧化应激、细胞凋亡等可进一步增加血脑屏障通透性。

血管生成素 （angiopoietin，Ang）是一族特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，其中血管生成素1（Ang-1）主要发挥保持血管内皮的稳定性，促使血管成熟的作用。在目前已知的能够促进血管生长的因子中，Ang-1是既能够促进血管再生又能够降低血管通透性的少数因子之一，已用于脓毒血症、移植血管硬化、糖尿病视网膜病变、心肌缺血等疾病的临床前期治疗［1］。Ang-1在正常脑组织中表达很少，脑缺血等病理状态下Ang-1的血浆含量发生改变，血管内皮细胞和血管旁细胞Ang-1的特异表达与脑缺血半暗带血管重建、侧支循环的形成和BBB的完整性密切相关［2］。

本研究利用局灶性脑缺血／再灌注大鼠模型，颈总动脉注射重组人血管生成素1（以下简称rhAng-1），研究局灶性脑缺血／再灌注7 d内，rhAng-1对血脑屏障内皮细胞间连接的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象 Wister健康大鼠 （n＝80），雄性、250～300 g。中国医科大学实验动物中心提供，实验动物置于室温和光照可控的饲养室内（22℃；每12 h为光照、黑暗一循环；光照从07∶00开始），自由进食水。

1.1.2 主要试剂及实验仪器 重组人血管生成素1（R＆D公司）；红四氮哇 （2，3，5-triphenyltetrazolium，TTC，Sigma公司）；伊文氏蓝 （Fluka公司进口分装）；大鼠脑立体定位仪（日本光电株式会社）；激光多普勒脑血流仪 （英国 Moor instruments公司）；酶标仪（美国 Molecular Devices公司）；-70℃超低温冰箱（SANYO公司）；恒温震荡水浴 （HZS-H，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；旋涡混合器 （XW-80C型，上海医科大学仪器厂）；Chemi Imager 5500 V2.03扫描系统；Fluor Chen 2.0和 Motic Images Advanced 3.2分析系统。

1.2 方法

1.2.1 制备局灶性脑缺血／再灌注动物模型 参照Longa大脑中动脉线栓法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）制备局灶性脑缺血／再灌注动物模型。大鼠腹腔注射 10%水合氯醛（0.3 ml／kg），麻醉后，仰卧固定，常规消毒后行颈部正中切口，充分暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。在颈外动脉与颈总动脉分叉处结扎颈外动脉，将直径为0.26 mm涂有肝素的尼龙线经颈总动脉进入颈内动脉约18～20mm，感觉有阻力时则为阻断大脑中动脉入口，栓塞成功后固定尼龙线，2 h后拔出尼龙线进行再灌注。

1.2.2 激光多普勒血流仪检测脑血流 麻醉大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪，正中矢状切开皮肤，在冠状缝后1 mm与矢状缝右5 mm交点处钻一小孔至硬脑膜，直径2 mm，该区域为缺血核心区域。将激光多普勒血流仪探头插入孔内，测量大鼠大脑中动脉血流变化。分别记录正常状态下脑血流基础值、缺血2 h内以及再灌注不同时间点血流变化。要求MCAO后脑流量迅速降到基础值的30%以下，不符合此标准的动物剔除。

1.2.3 实验分组 大鼠随机分为8组 （n＝10），假手术组、缺血对照组、生理盐水＋缺血／再灌注12 h，48 h，7 d组和 rhAng-1＋缺血／再灌注 12 h，48 h，7 d组。假手术组手术操作与模型制备相同，但不插尼龙线；缺血对照组仅缺血不再灌；rhAng-1各组大鼠颈总动脉注射 rhAng-1（1μg／kg），与再灌注同时开始，每24 h注射一次直至处死；生理盐水各组颈总动脉注射同剂量生理盐水。

1.2.4 脑梗死体积测定 大鼠过量麻醉致死后迅速断头取脑，置于-20℃冰箱快速冷冻30 min，从额极开始由前向后每隔2mm冠状切取脑组织5片，置于2%TTC溶液中，37℃水浴避光孵育30 min，数码相机拍照。用图像分析软件（Motic Images Advanced 3.2）处理计算脑梗死体积。

60只雄性BALB/C小鼠购自中科院生物研究所实验动物中心，小鼠体重为30±2 g，采用随机数字表法将所有小鼠随机分为3组，采分别为治疗组、损伤组和对照组，每组均为20只小鼠，

1.2.5 血脑屏障通透性的检测 向麻醉大鼠股静脉按 2ml／kg bw注入 2%伊文氏蓝（Evans blue，EB），2 h后经左心室灌注生理盐水直至流出清亮液体，断头取脑，按1 ml／100 mg脑组织加入甲酰胺溶液，60℃水浴抽提24 h，用酶标仪在620 nm波长测光密度值。作出标准曲线，得到脑组织EB含量（μg／g脑重量）。

1.2.6 神经功能评分 参照Zea Longer进行神经功能缺损评分：0分，无神经系统功能缺失症状，活动正常者；1分，不能完全伸展左侧前爪者；2分，爬行时出现向左侧追尾转圈者；3分，行走时身体向左侧倾倒者；4分，不能自发行走并伴意识障碍者。2～4分者纳入标准。

1.2.7 RT-PCR法检测紧密连接相关蛋白occludin、Zonula occluding-1（ZO-1）和粘附连接蛋白 VE-cadherinmRNA表达变化 取缺血区脑微血管段约100 mg按Trizol试剂说明书方法提取组织总RNA。取1μg进行RT-PCR反应。PCR引物序列及反应条件见表1。PCR产物用2%琼脂凝胶电泳分析。电泳后在紫外灯下拍摄照片，然后用Chemi Imager 5500凝胶成像处理系统对每一标本的PCR产物扩增的特异性片段进行灰度扫描，以β-actin密度作为参考定量标准，数值以两者之积分吸光度的比值表示， 以对照组的比值作为标准1.0。

Tab.1 Oligonucleotides used for RT-PCR and their amplicon size，genbank accession number and annealing temperatures

1.2.8 Western blot法检测紧密连接相关蛋白 occludin、ZO-1和粘附连接蛋白VE-cadherin以及信号分子PKCα和p-MLC表达水平变化 取缺血区脑微血管段，匀浆离心、测定蛋白浓度；蛋白分离分别采用7.5%、10%、15%SDS-PAGE电泳，转印到硝酸纤维素膜上；ZO-1（1∶500稀释）、occludin（1∶500稀释）、VE-cadherin（1∶500稀释）、PKCα（1∶500稀释）、p-MLC（1∶500稀释）、t-MLC（1∶500稀释）、β-actin抗体（1∶4 000稀释），4℃孵育过夜；相应二抗室温孵育2 h；ECL发光，采用Chemi Imager5500V 2.03软件扫描胶片，Fluor Chem 2.0图像分析仪对条带积分光密度进行定量分析。

1.3 统计学分析

所有数据以均数 ±标准差（±s）表示，采用SPSS 13.0软件进行数据分析。多组间采用单因素方差分析之Bonferroni检验。

2 结果

2.1 大鼠大脑中动脉供血区血流变化

激光多普勒血流仪检测生理盐水各组与rhAng-1各组大鼠大脑中动脉血流变化，大鼠脑血流以基础值百分比表示（图1）。结果显示给予生理盐水各组和给予rhAng-1各组大鼠再灌注各时间点缺血区脑血流量较MCAO时显著增高（P＜0.01），但给予rhAng-1与给予生理盐水大鼠同时间点缺血区脑血流变化无显著差异（图2）。

2.2 rhAng-1显著降低局灶性脑缺血／再灌注大鼠脑梗死体积

Fig.1 Effect of rhAng-1（1μg／kg）on the cerebral blood flow（CBF）in focal cerebral ischemia／reperfusion rats

Fig.2 Effect of rhAng-1（1μg／kg）on the cerebral blood flow（CBF）in focal cerebral ischemia and reperfusion rats（±s，n＝10）

Fig.3 rhAng-1（1μg／kg）decreased brain infarctvolume in focal cerebral ischemia／reperfusion rats（±s，n＝10）

2.3 rhAng-1显著降低局灶性脑缺血／再灌注大鼠血脑屏障通透性

应用伊文氏蓝渗透性实验评估BBB通透性变化。假手术组大鼠脑组织未见蓝染，给予生理盐水大鼠缺血区脑组织蓝染，脑切片可见缺血区额顶部皮质、尾壳核外侧部及中部蓝染。给予生理盐水大鼠各时间点缺血区脑组织EB含量与假手术组相比显著升高（P＜0.01）；给予 rhAng-1大鼠缺血区脑组织蓝染程度与同时间点给予生理盐水大鼠相比显著下降（P＜0.01，图 4）。

2.4 rhAng-1对局灶性脑缺血／再灌注大鼠神经功能的影响

应用Zea Longa法对大鼠进行神经功能损伤的评分。与假手术组相比，给予生理盐水各组及rhAng-1各组大鼠的分数显著升高（P＜0.01）；给予rhAng-1大鼠评分数与同时间点给予生理盐水大鼠相比无明显差异（图5）。

2.5 rhAng-1显著增加局灶性脑缺血／再灌注时微血管内皮细胞的occludin、ZO-1和VE-cadherin表达

2.5.1 RT-PCR法检测脑缺血／再灌注 12 h、48 h、7 d时，occludin、ZO-1和 VE-cadherin mRNA表达，以及应用 rhAng-1后 occludin、ZO-1和 VE-cadherin mRNA表达的变化 与假手术组大鼠相比，其他各组大鼠缺血侧脑组织occludin、ZO-1和VE-cadherin的mRNA表达均显著降低（P＜0.01）；与同时间点给予生理盐水大鼠相比，给予rhAng-1大鼠缺血侧脑组织occludin、ZO-1和 VE-cadherin mRNA表达均显著增加（P＜0.01，图 6）。

Fig.4 Content of EB showed that rhAng-1（1μg／kg）decreased the BBB permeability in focal cerebral ischemia／reperfusion rats（±s，n＝8）

Fig.5 Effect of rhAng-1（1μg／kg）on the neurobehavioral dysfunction score in focal cerebral ischemia／reperfusion rats（±s，n＝8）

2.5.2 Western blot法检测局灶性脑缺血／再灌注12 h、48 h、7 d时，occludin、ZO-1和 VE-cadherin蛋白表达以及应用rhAng-1后这些蛋白表达的变化 与假手术组大鼠相比，其他各组大鼠缺血侧脑组织三种蛋白表达皆显著降低（P＜0.01）；与同时间点给予生理盐水大鼠相比，给予rhAng-1大鼠缺血区脑组织三种蛋白表达均显著增加：occludin（P＜0.01或P＜0.05）、ZO-1（P＜0.01）和 VE-cadherin（P＜0.01，图 7）。

Fig.6 RT-PCR analysis revealed that rhAng-1（1μg／kg）induced increasing mRNA levels of ZO-1，occludin，and VE-cadherin in focal cerebral ischemia／reperfusion rats（±s，n＝8，10）

3 讨论

本实验结果显示大鼠在局灶性脑缺血／再灌注12 h，48 h和7 d，BBB通透性显著高于假手术组，应用rhAng-1能够显著降低再灌注大鼠BBB的通透性，显著减少再灌注12 h，48 h和7 d组大鼠脑梗死体积，但未明显提高神经功能损伤评分。结果证明，rhAng-1对局灶性脑缺血／再灌注大鼠BBB的通透性具有保护作用，这种保护作用与rhAng-1增加BBB内皮细胞间连接蛋白的表达有关。

Fig.7 Western blot assay showed that rhAng-1（1μg／kg）induced increasing protein levels of ZO-1，occludin，and VE-cadherin in focal cerebral ischemia and reperfusion rats（±s，n＝8）

局灶性脑缺血／再灌注大鼠脑血流变化显示，再灌注后缺血区脑血流增加，与MCAO时存在显著差异，但缺血区脑血流在再灌注7 d内并没有恢复到基础水平，说明此期间的再灌注是持续的低灌注水平。BBB通透性实验的结果显示给予生理盐水大鼠再灌注12 h，48 h和7 d三个时间点BBB通透性显著高于假手术组，与Strbian用磁共振法检测到的脑缺血／再灌注BBB通透性变化相一致［3］。提示再灌注期间脑血流供给的不足与BBB的通透性增加可能存在一定关系。

再灌注开始引起脑血流急剧升高，中性粒细胞大量粘附于脑血管内皮细胞阻塞微血管，引发“无复流”现象，形成持续低灌注，缺血区域局部血液供给减少，脑组织代谢障碍，血管内皮细胞和星型胶质细胞发生肿胀，造成BBB通透性增加［4］。能量代谢障碍伴随着的氧化应激反应、离子失衡、神经递质释放与重摄取障碍，导致BBB损伤加剧［5］。随着再灌注时间的延长，中性粒细胞大量渗出，小胶质细胞大量激活，各种炎症因子释放直接损伤内皮细胞，使BBB通透性持续增加，继发脑水肿、甚至脑出血［6］。Kuroiwa等研究表明，脑缺血／再灌注损伤引起BBB通透性呈双峰变化，第一高峰为再灌注早期，此期又为充血期，由于急剧升高的脑血流破坏脑血管内皮细胞引起BBB通透性增高，而持续低灌流继发的炎症反应引起BBB通透性变化出现第二高峰［7］。我们在前期实验中发现在局灶性脑缺血／再灌注损伤时BBB通透性增高的第一个高峰发生在再灌后12 h，第二个高峰在再灌后48 h。基于此，本研究选择再灌注12 h，48 h和7 d三个时间点观察BBB通透性变化。

血管生成素是一种有效的血管生成因子，是RNase超家族中惟一具有促血管生成能力的成员，也是目前已知的所有血管生成因子中独具核糖核酸酶活性的因子。Ang-l的功能有抑制血管内皮细胞的凋亡、促进内皮细胞出芽、迁徙和成熟以及抗炎、维持血管稳定和抗血管渗漏［8］。Ang-l发挥抗皮肤血管渗漏的作用是通过稳定细胞间粘附连接复合体实现的［9-10］。Ang-1在正常脑组织中表达很少，脑缺血等病理状态下Ang-1的血浆含量发生改变，血管内皮细胞和血管旁细胞Ang-1的特异表达与脑缺血半暗带血管重建、侧支循环的形成和BBB的完整性密切相关［2］。关于脑缺血与Ang-1表达水平关系的研究表明Ang-1在正常生理条件下能够参与维持正常成年大脑的BBB完整性；脑缺血发生后，Ang-l表达减少、作用减弱加重BBB完整性的破坏。本研究通过在脑缺血／再灌时给予外源性 rhAng-l观察rhAng-l对病理状态下的BBB是否具有保护作用。rhAng-l的给药途径及剂量通过预实验得出（颈总动脉给药，1μg／kg）。结果证明 rhAng-l对局灶性脑缺血／再灌注大鼠BBB通透性具有保护作用。rhAng-l保护BBB的确切分子机制有待进一步证明。

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