CD163受体在PRRSV 入侵过程中的作用机制

宋晓晖，王淑娟，张衍海，冯春燕，李秀峰

（1.中国动物疫病预防控制中心，北京100125；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032；3.中国检验检疫科学研究院 动物检验检疫研究所，北京10029）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）具有非常严格的细胞嗜性，这种嗜性很大程度上取决于细胞表面是否存在特异性的病毒受体。目前已鉴定到的PRRSV受体有硫酸乙酰肝素（heparin sulfate，HS）、唾液酸黏附素（sialoadhesin，Sn），CD163、波形蛋白受体（vimentin）等。PRRSV入侵细胞过程中，首先与细胞表面的硫酸乙酰肝素结合，起始入侵过程，接着结合唾液酸黏附素，使病毒和细胞的结合更加稳定。进一步通过钙黏素介导的内吞作用介导病毒-受体复合物进入胞内。在吸附-侵入末期，病毒同宿主细胞CD163相互作用，释放基因组，开启复制过程。在PRRSV侵入感染宿主细胞过程中Sn和CD163是最主要结合和内化受体，因此成为PRRSV入侵机制研究进展的热点。本文对CD163在PRRSV入侵过程中作用机制的研究进展进行总结，为进一步阐明病毒的入侵机制，寻找新的抗病毒靶位点等研究提供一定的理论基础。

1 CD163的结构和功能

CD163属于富含半胱氨酸的清道夫受体（scavenger receptor cysteine-rich，SRCR）超家族成员。根据每个SRCR区域半胱氨酸残基数量，清道夫受体超家族又分为A群和B群。A群受体的典型特征是每个SRCR由2个外显子编码，为6个半胱氨酸残基，而B群受体的每个SRCR由一个外显子编码，为6个到9个半胱氨酸残基。根据是否含有除SRCR外的其他胞外区，将B群受体又分成2个亚群。CD163属于B群清道夫受体的第1亚群［1］。CD163分子只在单核细胞和巨噬细胞上表达，在成熟巨噬细胞丰富的肝脏、脾脏、淋巴结、骨髓细胞中高表达。新鲜分离的外周血单核细胞中CD163分子表达水平很低，在细胞进一步分化为巨噬细胞后，其表达量增加。肿瘤坏死因子（TNF），干扰素γ，脂多糖（LPS），转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等能下调 CD163的表达，相反，类固醇，白细胞介素6（IL-6），白细胞介素10（IL-10）等能促进 CD163表达［2］。

首次鉴定到CD163的时候，就推测CD163可能在炎症反应中发挥作用，但一直没有找到与其相互作用的配体。直到2001年，Kristiansen M 等［3］研究发现，CD163分子与血红蛋白-结合珠蛋白复合物（Hemoglobin-haptoglobin，Hb-Hp）相互作用，在抗炎、抗氧化过程中发挥作用。游离Hb被Hp捕获后，形成的Hb-Hp复合体会呈现出新的抗原决定簇，结合CD163分子。最近，丹麦奥胡斯大学的科学家们成功的解析了Hb-Hp复合物的晶体结构，发现从复合物的远端表面突出的结合珠蛋白环正是CD163的结合位点［4］。CD163结合 Hb-Hp后，启动细胞内信号通路，导致IL-10释放。随后，CD163-Hb-Hp复合物内化进入巨噬细胞，在初级内体中，CD163解离，重新回到细胞膜，而Hb-Hp进入溶酶体，在其中被血红素氧合酶（heine oxygenase，HO）降解为胆绿素、Fe2＋和CO。在整个结合过程中产生的IL-10和CO，能够产生非常强的抗炎效果［5］。研究发现，肿瘤坏死因子样凋亡微弱诱导剂（tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK）能够与CD163特异性的结合。TWEAK作为肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族的新成员之一，最初是从人扁桃体和胎肝cDNA文库中筛选出，因其能微弱诱导肿瘤细胞凋亡故将其命名为TWEAK。TWEAK可以与细胞表面的特异性受体Fn14结合，发挥诱导细胞凋亡，促进血管生成、炎症反应及细胞增殖、迁移、分化等一系列生物学活性。研究发现，CD163分子作为TWEAK的特异性受体，同TWEAK相结合后，能抑制TWEAK的自嗜活性［6-7］。

CD163不仅同内源性配体结合，调节炎症反应，还能够同外源性配体如细菌、病毒结合。CD163在细胞表面表达，能够有效地结合细菌。已经发现，革兰阴性菌和革兰阳性菌都能够同CD163结合。目前已经鉴定到两个主要的结合点，一个是在CD163的第2个SRCR中的FRIEIKFQGRW功能域，为主要结合位点，另一个是在第3个SRCR中的GRLEVRFQGEW功能域，其结合效率低于第一个结合位点。CD163同细菌的结合后，会促进吞噬细胞分 泌 TNF-α、IL-1β、IL-6等前 炎 症 细 胞 因 子［8］。除了细菌，CD163在病毒感染过程中也发挥非常重要的作用。已经证明CD163是非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）以及PRRSV入侵宿主细胞的重要受体分子［9-10］。

2 CD163在PRRSV感染中的作用

Calcert J G等［11］首次报道CD163为PRRSV入侵细胞的受体之一。他们在筛选原代猪肺泡巨噬细胞cDNA表达文库时发现，CD163能够使PRRSV非敏感细胞系变成PRRSV敏感细胞系。将猪、犬、老鼠、人以及非洲绿猴来源的CD163转染到幼仓鼠肾传代细胞（BHK-21）、猪肾细胞、猫肾传代细胞系（NLFK）等PRRSV非敏感细胞系后，这些细胞能够允许PRRSV的复制和增殖。Van G H等［10］发现类人猿的CD163在PRRSV感染猴肾细胞（MARC-145）中起十分关键的作用，并且用CD163抗体与MARC-145细胞孵育，能有效抑制病毒感染。Patton J B等［12］利用流式细胞术，发现CD163的表达同PRRSV的复制水平呈正相关。用TPA和LPS等抗炎因子处理猪肺泡巨噬细胞（PAM）和单核巨噬细胞（MDM）降低CD163表达水平，病毒的复制水平也会降低。相反如果用IL-10等上调CD163表达的分子刺激细胞，病毒感染水平相应增加。原代PAM细胞是PRRSV敏感细胞，通过在PAM细胞中转入SV40的大T抗原，能够获得永生化PAM细胞系3D4／21，该永生化的细胞系失去PRRSV的敏感表型，并且在其中PAM细胞中检测不到 CD163的表达［13］。Lee Y J等［14］发现把CD163基因转入到永生化PAM细胞系中，能使这些细胞再次获得对PRRSV的敏感性。并且，在福尔马林固定的细胞表面能够检测到稳定表达的CD163。同时用免疫印迹方法，在细胞裂解物中能够发现大量表达的CD163。Wang L等［15］研究发现，在体外PRRSV不能感染不表达Sn和CD163的外周血单核细胞，但用猪血清以及L929培养基培养这些细胞后，96h内细胞CD163的表达水平上升50%，同时PRRSV也能够在这些细胞中复制，并且复制水平与在PAM中的复制水平相当。这些试验结果都表明了CD163分子在病毒的入侵、感染过程中发挥重要的作用。

进一步研究发现，CD163在病毒脱衣壳和基因组释放过程中起关键性作用。将CD163特异性抗体与肺泡巨噬细胞37℃孵育后，PRRSV感染被抑制。但如果在4℃孵育则对感染没有影响，这说明CD163并不参与PRRSV吸附过程，而是参与病毒基因组复制过程。瞬时表达CD163，能够使非敏感细胞变成敏感细胞系，但内化的病毒非常少，PRRSV只有在部分细胞中有效复制。瞬时表达Sn，能观察到大量病毒发生内化，但复制增殖的病毒很少。同时表达CD163和Sn能够使病毒复制水平大大增加，超过单独表达CD163［10］。这说明Sn作为病毒结合和内吞的受体，而CD163是病毒复制增殖的关键性受体［16］。

3 与CD163结合的PRRSV囊膜蛋白

在PRRSV囊膜上，有糖蛋白GP5、GP2a、GP3、GP4以及非糖基化M蛋白和2b蛋白。GP5在病毒囊膜表面数量最多，被称为大囊膜蛋白，GP2a、GP3、GP4等蛋白数量少被称为小囊膜蛋白。这些糖蛋白在病毒组装、病毒同细胞表面受体相互作用以及病毒释放过程中都发挥着重要作用［17］。由于GP5与M蛋白形成聚体，并且在囊膜上数量最多，因此，最早认为GP5和M蛋白在病毒同受体相互作用过程中发挥重要作用。但对马动脉炎病毒（Equine viral arteritis，EAV）的相关研究发现，将GP5和M蛋白的胞外区域用PRRSV或者LDV的相应胞外区域替换，并不改变病毒的细胞嗜性，说明GP5不是结合CD163的特异性受体［18］。进一步研究发现，小囊膜蛋白在同CD163受体相互作用过程中发挥重要作用。在BHK-21中共表达 GP2a、GP3、GP4或GP5及CD163子，表达产物在细胞裂解和免疫共沉淀后，用CD163特异性抗体杂交。结果发现CD163特异性抗体除了结合CD163，还能结合GP2a和GP4。进一步用特异性单抗检测发现，单独表达的GP2a或者GP4不能结合CD163分子，两者共同作用才能结合CD163［19］。这说明在PRRSV与CD163相互作用的过程中，GP2a和GP4是关键的结合分子。最近通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）分析技术发现，GP4是最主要的CD163的结合分子［20］。GP4是Ⅰ型膜蛋白，但C末端没有疏水尾巴，突变GP4上1个或者2个糖基化位点，对于PRRSV复制没有影响，同时突变3个到4个，病毒则不能复制，糖基化并不影响GP4同CD163的结合［21］。最近研究发现GP4为脂锚蛋白（lipid-anchored membrane protein），能够同CD163共沉淀在细胞膜的脂筏（lipid rafts）上［22-23］。

除了GP2a和GP4的特异性结合，其他的糖蛋白GP5、GP3以及非糖蛋白M在同受体的相互作用过程中也可能发挥非特异性结合的作用。在感染细胞中，PRRSV囊膜蛋白形成复合体后，才能从内质网向高尔基体运输，最后到达质膜，装配到病毒粒子表面［24］。因此，CD163与PRRSV的结合过程，很可能是囊膜蛋白复合体与CD163的相互作用过程。冷冻电镜观察发现，病毒囊膜表面看起来非常的光滑，虽然囊膜表面GP5和M蛋白数量多，但是由于形成的聚体不够大，因此不能观察到。但是在光滑的病毒离子表面能够观察到一些大的凸起，这些大的凸起非常像大的蛋白复合物的聚体。因此推测在病毒囊膜表面，GP3-GP2a-GP4与GP5-M形成大的蛋白聚体，在病毒与其细胞受体相互结合过程中发挥作用。其中GP4一方面调节小结构蛋白复合体GP3-GP2a-GP4与大结构蛋白GP5结合，另一方面与GP2a相互作用结合CD163，促进病毒基因组的释放。其他相关研究发现GP5-M复合物能够非特异性的结合肝素样受体。因此推测很可能在大蛋白复合体中GP5-M与CD163分子之间也存在非特异性结合。除了糖蛋白，囊膜表面的2b和M蛋白在病毒与受体相互作用过程中也发挥一定的作用，相关的研究也正在开展。与病毒相互作用的受体蛋白或者相互作用的关键区域能够诱导机体产生高水平的针对性中和抗体，一直以来是疫苗研制或者治疗的理想靶标。GP2a和GP4带有CD163的受体结合区域，因此是PRRSV疫苗研制和治疗的非常理想的分子［25］。

4 参与PRRSV感染的CD163的功能域

CD163分子由N端9个SRCR区域，一个24个氨基酸组成的跨膜区以及C端一个短的胞浆尾组成。胞浆尾与蛋白酶C以及肌酸激酶具有相同的磷酸化序列，其中带有内化功能域Yxxφ。研究发现胞浆尾不仅影响PRRSV对细胞的敏感性，还影响病毒在细胞中的复制水平［26］。CD163还有2个脯氨酸丝氨酸苏氨酸富集区（PST），一个在第6个和第7个SRCR之间，另外一个在SRCR9与跨膜区域之间［26］。目前通过定点突变以及嵌合突变的方法，鉴定到了CD163分子与PRRSV相结合的关键位点。定点突变研究发现将CD163的胞浆内序列突变并不影响其受体活性，而如果将其胞外域全部缺失，CD163完全丧失其活性，PRRSV病毒不能够在这样的细胞中复制。说明CD163的关键功能区都在胞外［27］。与CD163同属于清道夫受体超家族B群的CD163-L1与CD163的结构非常相似，但是在PRRSV病毒复制过程中不能发挥受体作用。通过利用CD163-L1的相关区域对CD163进行的嵌合突变发现，SRCR5是CD163与PRRSV相互作用的关键功能域。在用CD163-L1的SRCR5替代CD163的相关区域后，PRRSV在突变细胞中不能复制、增殖［27］。根据已经发表的M2BP的晶体结构，通过对人CD163的9个SRCR序列比较，推测出SRCR5中第5和第6个环是主要的结合区域，而SRCR其他区域则起到结合脚手架的作用。除了SRCR5，研究发现，SRCR6、PST1和PST2区域虽然对PRRSV复制没有决定性作用，但是对病毒复制量有一定的影响［28］。胞外 N 端的 SRCR1、SRCR2、SRCR3不影响CD163与PRRSV结合的受体活性。Hb-Hp复合物能够与CD163相结合，结合位点正好位于SRCR2，SRCR3，因此对CD163与PRRSV的结合没有作用［9］。CD163作为不同病毒的受体，其关键功能区域也不同。研究发现单克隆抗体2A10能够抑制ASFV感染以及病毒粒子与巨噬细胞结合，并且结合位点恰好位于SRCR1-SRCR3之间。因此单克隆抗体2A10能够抑制ASF病毒感染，但是不能抑制PRRSV感染。因为CD163与ASFV结合的关键性位点正好位于SRCR1-SRCR3内［29］。

总之，随着对CD163与PRRSV糖蛋白相互作用研究的深入，已经提出了PRRSV在细胞膜上与CD163相互作用的模型，并且初步描绘了病毒在细胞中复制的过程。但是，作为PRRSV细胞内复制的重要受体，CD163与病毒的相互作用启动了一连串动力学过程，目前对这个过程了解还很少，特别是CD163分子参与的病毒基因组的释放过程的整个机理还是不清楚，因此还需要大量的基础研究才能揭开PRRSV进入细胞后复制的全貌。

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