大肠埃希菌强毒力岛致病机制研究进展

卢 琴，严玉霖，高 洪，高利波，赵 汝，李祥峰，邵志勇，臧雅婷，崔艳艳

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

大肠杆菌病是由致病性大肠埃希菌（E.coli）引起的急性肠道传染病的总称。大肠埃希菌是动物肠道共生菌的正常组分。通过其他的致病菌和基因重组发生水平转移，特别是己获得毒力基因的大肠埃希菌菌株能在人和动物间引起大范围的肠道或肠道外感染［1］。在猪和牛，肠道外大肠埃希菌能引起新生幼畜败血症死亡［2］。一般来说，大肠埃希菌通常不致病，但当宿主免疫力下降或细菌移位侵入肠道外组织器官时，可引起宿主感染，严重的甚至可导致败血症、新生儿脑膜炎。强毒力岛（High pathogeniticity island，HPI）首先发现于耶尔森菌，因此被命名为耶尔森菌强毒力岛。耶尔森菌HPI广泛分布于肠道致病菌中，主要含有与铁摄取有关的毒力基因簇，编码参与合成及摄取铁载体耶尔森菌素（yersiniabactin）的铁抑制蛋白irp（iron-repressible protein）基因及其调控基因，行使铁摄取功能，细菌只有通过强有力的铁摄取机制从宿主摄取铁元素，才有可能在宿主机体内生存，使宿主发病来介导感染过程。其核心功能区的irp2-irp1-ipr3-irp4-irp5-fyuA基因簇被称为irp2-fyuA基因簇，是参与合成介导铁摄取功能系统的铁载体耶尔森杆菌素的主要基因组分，它们在不同类型的耶尔森菌中高度保守，编码参与合成及摄取耶尔森铁载体的基因及其调控基因，行使铁摄取功能，增强细菌在宿主体内存活的概率［8］，与机体的致病性密切相关。HPI的各基因水平转移与缺失等的差异，以及不同的肠道致病菌及其种属间的HPI的携带的不同，使其大肠埃希菌的致病越发复杂。而大肠埃希菌的致病机制包括两部分，一部分为毒力因子，主要为黏附素系统（菌毛、非菌毛黏附素、F1、P、F17等）、铁离子摄取系统（气杆菌素、肠杆菌素）和外膜蛋白；另一部分为分子致病机制，其主要是编码染色体上的毒力因子基因，如耶尔森菌HPI、肠细胞脱落位点（LEE）毒力岛、OI毒力岛等。现就致病性大肠埃希菌HPI的致病性研究现状做一综述。

1 基本特征

HPI的全序列由Rakin于1999年2月测定并公布［3］，长为43 493bp，其基本特征为：编码载有耶尔森菌素与毒力相关性的基因且仅存在于强毒株，如小肠结肠炎耶尔森菌（Y.enterocolitica，Yen）中仅有1B生物型才具有完整的Yen HPI；G＋C mol%与耶尔森菌染色体有明显差异（一般高于）；大的染色体片段（大于35kb）；为一紧密、明确的遗传学单位，两端通常为顺向重复序列DR17；一侧外缘与asn tRNA基因相连；载有“可移动”的基因［4-5］。但Yen HPI具有相对的稳定性，而现在发现的毒力岛则具有不稳定性的特点。且耶尔森菌HPI与大肠埃希菌之间能存在水平转移。

耶尔森菌HPI是细菌重要的致病因素，也是大肠埃希菌重要的毒力因子，其中irp2为铁调节蛋白，是HPI的标志基因。在实际应用中可针对irp2设计特异性引物，对己经过生化鉴定为大肠埃希菌的菌株，提取DNA，以此DNA为模板PCR方法扩增出特异性条带后，其大小与设计的irp2片段大小进行比较，以此来检测此菌株是否含有HPI。

2 分子致病机制

2.1 耶尔森菌HPI

最早用来描述泌尿道致病性大肠埃希菌的2个相对分子质量很大的、编码许多毒力相关基因不稳定的染色体DNA片段，能在大肠埃希菌间发生水平转移。现大量的研究表明，HPI能介导细菌的致病性，含有HPI的菌株致病性强于没有HPI的菌株。王斌等［6］的研究表明，在耶尔森菌中，HPI毒力岛的存在与其致病性密切相关，含HPI毒力岛Ybt的功能失活直接导致菌株致小鼠毒性明显下降，说明了HPI决定着细菌毒力或致病力的强弱。Schubert S等［7］研究表明共轭转移和同源DNA重组在不同类别的大肠埃希菌的毒力岛的水平转移起重要作用。

吕殿红等［8］用携带有HPI的大肠埃希菌对雏鸭进行致病性试验，结果表明，同样基因型的HPI所表现出来的致病性的强弱有所区别。魏文康等［9］的试验结果表明，大肠埃希菌HPI相关毒力因子的携带情况不尽一致，进行同源性比较，而irp2、fyuA、tsh和iucD基因与GenBank中的参考序列同源性很高，但iss基因序列却有差异，因而认为在细菌进化过程中发生了较大程度的变异，而且在不同动物源的大肠埃希菌中发生了水平传递。徐继英等［10］证实了耶尔森菌HPI在奶牛乳腺炎源大肠埃希菌中广泛流行分布，但也存在差异，而不同血清型菌株携带HPI的倾向性可能只与特定的血清型有一定的关系。铁离子对所有微生物都是必需的营养成分，并且作为基本酶反应体系的成分，参与体内有氧代谢、电子转运过程、DNA或RNA的合成等。细菌只有通过强有力的铁摄取机制从宿主夺取铁无素，而在一个限铁的环境下，特异性的建立起高度亲合性的铁摄取系统，通过释放称为铁载体的小分子物质来应对许多缺铁性的生长环境，然后它们利用特异性的转运系统再摄取这些螯合了铁的铁载体［11］，从而有利于细菌的生长。可以在试验中用有铁或无铁的情况下观察细菌的生长状况，从而反映铁在细菌生长过程中所起的作用，来更进一步地揭示其致病机理。目前常用CAS［12］（铬天青S）平板法来检测是否有铁载体的参与，其机理为将强配体L（如铁载体）加入到深染的铁染料复合物中，一旦此铁配体复合物形成释放游离的染料，有颜色变化。（FeDye3-λ＋Lκ-FeL3-κ＋Dyeλ-），而在无铁的情况下观察铁的表达量，主要是通过SDS-PAGE方法，在2-2′-联吡啶（铁螯合剂，可以结合培养基中的铁离子，使细菌生长环境处于铁缺乏状态）终浓度为0.2mmol／L的状态下，加入50μL甘油冻存的HPI阳性菌株，于10mL LBD培养基中，37℃200r／min培养18h～24h，最后配制60g／L分离胶和50g／L浓缩胶进行SDS-PAGE凝胶电泳。通过对比分析HPI的摄铁能力。Garemax A等［13］研究结果表明通过胚胎载体摄铁对肠道外致病性大肠埃希菌的毒力有很大的作用，因为需要外膜蛋白的参与，可以构建一个位点来制备疫苗来控制动物的肠道外致病性大肠埃希菌等传染病。李叶芳等［14］通过试验证实了禽致病性大肠埃希菌中强毒力岛的摄铁能力与其致病性有密切的联系。耶尔森菌HPI的致病性通常是与机体的摄铁系统联合起来的，一般来说，HPI的主要作用作用在于机体在缺铁的情况下，能通过铁载体摄铁，从而行使致病作用。

2.2 肠细胞脱落位点（LEE）毒力岛

大肠埃希菌的致病性，主要通过菌体与肠黏膜上皮细胞的紧密黏附，致使肠上皮细胞微绒毛消失，细胞骨架发生改变，丝状肌动蛋白聚集等组织病理学损伤，这种损伤称为黏附与脱落（A／E）。引起A／E损伤的所有基因都位于大肠埃希菌基因组被称为肠细胞脱落位点（LEE），又称为LEE毒力岛。这些基因主要包括编码Ⅲ型分泌系统（esc或sep），分泌型蛋白质（esp）及其分子伴侣；紧密素易位受体（tir）和外膜蛋白紧密素（eae）等基因。Ⅲ型分泌系统是许多病原菌用来分泌毒力蛋白或把这些蛋白直接注入宿主细胞以启动生化信息传导［15］；espB可以通过细菌表面与细胞之间的通路到达宿主细胞［16］，主要是运输一些毒力蛋白；紧密素是一个双功能分子，能在形成A／E损伤时作为细胞黏附到紧密素易位受体，同时又能增加黏膜应答时的免疫病理。

3 小结及展望

大肠埃希菌血清型众多，易继发感染，其流行地域性强，耐药性突出，暴发率高［17］。毒力岛作为细菌染色体上一段具有典型结构特征的基因簇，与多种致病毒力因子的产生和细菌的进化有密切的关系［18］。毒力岛的发现使我们对细菌的致病性有了更进一步地认识，也了解到大肠埃希菌致病是由多方面因素作用的最终表现。从引起的病变来看，都不是一个因素作用的结果。因此，在以后的研究过程中，研究两种或两种以上的致病因素，将成为了解大肠埃希菌致病机制的突破口。气候、应激、机体本身状况等变化都将导致机体发病，所以在实际生产中应从各方面考虑，以便更好地预防大肠杆菌病的流行。大肠埃希菌的致病机制较复杂，大肠埃希菌HPI各基因的水平，以及在不同菌株中的分布率的不同，以及大肠埃希菌血清型与HPI阳性率的相关性，可以通过HPI与其相关的致病机制联合起来进行研究，对于认识细菌的进化规律、阐明病原菌的致病机理，以及认识和预测新发传染病等方面有着重要的意义。

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