单核苷酸多态性在法医学领域的应用前景

孔庆波，施 念

（1.重庆警察学院，重庆401331；2.重庆市公安局刑警总队，重庆401331）

随着人类基因组研究的深入，遗传标记技术相继开发，对人类生命密码的解读越来越透彻。在此基础上，相关领域的不断融合、交叉和借鉴，致使法医物证检验技术在此领域也得到了长足的发展。从20世纪90年代STR分型技术逐渐应用于法医鉴定开始，多达9个乃至15个STR位点的复合扩增结合荧光自动测序仪的使用，使法医物证鉴定效率大幅度提高。然而，1997年SNPs标记策略的提出［1］，在整个生物学界引起了基因多态性研究的新一轮热潮，为法医物证检验发展提供了新的前景。

1 SNPs概述

1.1 SNPs的含义

SNPs是单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）的简称，指基因组内特定核苷酸位置上存在着两种不同的碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1%。SNPs主要是由基因组水平上的单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。SNPs包括了人类基因组已知多态性的80%，是最常见的遗传变异类型。与RFLP、STR相比，SNPs更广泛地存在于基因组中，分布密度及数量均远远多于其他类型的DNA多态性。SNPs在单个基因或整个基因组中并不是均匀分布的。

1.2 SNPs的应用

SNPs分析在遗传学、医学研究上发挥着巨大的作用，其主要用途可归纳为以下三个方面［2］：

（1）医学遗传学方面：SNPs在同一位点上较少的多态性和在基因组中的丰富性，使之适合于自动化大规模扫描，成为第3代遗传图谱标记技术，标记密度可从10cm提高至1cm～2cm。在此基础上，可进行疾病遗传学研究。

（2）群体遗传学方面：通过对比人群之间SNPs图谱的异同程度，研究人类进化过程中的起源与分流［3］。

（3）药物基因组学（pharmacogenomics）方面：通过研究与药物活化、代谢或靶分子有关基因的SNPs，找出不同个体对药物敏感性或耐受性的相关基因［4］，实现个性化医疗。

进行法医学应用性研究主要是在群体遗传学方面，包括种属特异性、同质性、遗传方式、突变率等。SNPs序列较短，尤其适用于高度腐败、降解、陈旧的法医生物检材。

2 SNPs检验在法医学领域的应用

正常男性拥有一条Y染色体，正常女性没有Y染色体。Y染色体的性别决定功能意味着他是父系遗传，且呈单倍型向下传递，不发生重组，除积累的突变外，由父亲无变化的将其传递给儿子。Y染色体遗传标记的这些特征，使SNPs在法医学中具有独特、潜在的巨大作用［5］。

2.1 SNPs检验应用于法医学的方法

2.1.1 SNPs检验应用于法医学的特点和优点SNPs只涉及单个碱基的变异，因而检验SNPs意味着从单核苷酸水平对每个个体的DNA序列多态性进行最本质的鉴别和区分，这在法医个人识别和亲子鉴定中具有巨大的意义。同其它遗传标记相比，SNPs具有以下适用于法医学检验的特点和优点［2］：

（1）SNPs位点含量的丰富性及分布的高密度性。虽然SNPs单位点可以提供的信息相对较少，但分布的高密度弥补了信息量的不足。

（2）SNPs的遗传稳定性。SNPs被认为是一种能稳定遗传的早期突变，较STR等多态标记具有更高的遗传稳定性［6］，这对于亲子鉴定来说更有意义。

（3）SNPs检验技术自动化的可行性。SNPs标记作为双等位基因，结果只表现为简单的“＋／-”或“有／无”形式，这使SNPs的检验方法易于实现自动化或全自动化。

2.1.2 SNPs检验应用于法医学的方法 以下为近年来法医物证检验常用的几种较有前景的SNPs高通量检验技术：

（1）DNA 芯片技术：DNA 芯片（DNA chip，又称基因芯片，生物芯片）技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入，使核酸杂交技术实现集成化，可以一次性对样品大量序列进行实时、灵敏、准确的检验和分析。法医DNA检验的未来有赖于DNA芯片技术的应用，快速检验几百个SNPs多态性位点，并有希望制成小型化的现场包。在法医学领域，将以DNA芯片为基础技术，建立第三代DNA分析技术。

（2）寡核苷酸连接检验（oligonucleotide ligation assay，OLA）技术［6］：该方法可使法医SNPs检验进一步自动化。

（3）MALDI-TOFMS（matrix-assisted laser desorption／ion-ization mass spectrometry）检验技术：对SNPs检验而言，以下两种方法较有前景，即肽核酸（peptide nucleicacid，PNA）探针技术和引物延伸技术（primerextension）（也称为微测序技术），可实现对SNPs的高通量检验［7］。

（4）Taq Man荧光探针技术［8］：Taq Man技术实现了PCR的实时定量检验，并且因整个反应过程一次加样，在密封体系中进行，可将PCR污染的风险降至最低。

（5）其他新方法：近年来，进行SNPs分型的新技术层出不穷，如等温环扩增技术（isothermal rolling circle amplification，RCA）、温度调控高效液相色谱技术（temperature-modulated high-performance liquid chroma-tography，TmH PLC）、焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。

2.2 SNPs检验在法医学领域的应用前景

2.2.1 在个体识别中的应用 性别鉴定是法医学中个体识别的重要内容之一。以往进行性别鉴定通常检验Y染色质、性激素、男女之间的差异性蛋白等来判断。由于对检材的要求较高，在实践检案中难以应用。在个体识别中的另一应用是身份鉴定，SNPs在法医学上与选择性STR位点有着同样的功能，它们为身份鉴别提供了基因信息。

DNA在各种生物学检材中比较稳定，而且检验技术稳定、灵敏，已广泛应用于法医的实践中。特别是以SNPs为代表的新一代遗传标记。SNPs是人类基因组中最常见、分布最广泛的DNA多态性类型，大约90%的人类遗传变异是单核苷酸多态性。研究表明，SNP数比微卫星标记数要高出几个数量级。SNPs是二等位基因，多态信息含量不如多等位基因STR［9］，但其比STR更易通过扩增，在人群中容易通过各种不同的方法确定等位基因频率，而且筛选只需通过有或无的分析。

目前，已经有一些SNPs鉴定试验应用于个人识别的报道，如由欧洲法医实验室开发的21SNPs嵌板和 52SNPs嵌板［10］。与此同时，Kidd K K等［11］举例说明了身份鉴定SNPs位点的选择和嵌板的研发标准。用这种标准进行评估的结果是在40个人群中筛选出19个具有高度杂合性和低的Fst值的身份鉴定SNPs。进一步的研究已经在进行中，将会鉴定出更多符合的SNPs以满足当前身份鉴定的需要。

2.2.2 在亲权鉴定中的应用 SNPs标记数目多，覆盖密度大，在法医鉴定中具有巨大的潜力。SNPs多态性虽然发现才短短几年，由于突变率低，相对稳定，在法医学中的亲权鉴定应用价值极大。通过Y染色体的SNPs单倍型分析，当孩子是男孩，亲权鉴定出现疑问或者没有母亲参与时，通过对Y染色体SNPs单倍型的分析，可进行单亲的父子对亲子鉴定。利用Y染色体的SNP单倍型（男性特异性）分析，还可以进行兄弟关系、叔侄关系、爷孙关系的鉴定等。

中华民族的家系以父系姓氏为主，海外侨胞、知名人士寻根问祖需鉴定是否为同一父系宗亲，财产继承需鉴定是否具有父系亲缘关系等，检验Y染色体遗传标记显然有其他检验手段无法替代的作用。

2.2.3 在推测个体生物地理起源中的应用 个体的生物地理起源可以间接地提供一些一般的外貌信息，对调查有指导价值。法医学STR位点虽然是很好的鉴定标记，但它们不适合用来定义个体的生物地理起源，因为人群中的等位基因是高度共享的。Y染色体和线粒体DNA单倍型因其是单亲遗传和有限的人类基因组代表性也不能作为表型的间接预测标记。而始祖多态位点（AIMs）是遍布于人类基因组的SNPs，并且在世界不同人群中的出现频率不同。它们能够判断样本的生物地理起源，从而间接地推测一些表型特点，但不能检验出外貌特征，因而是一种表型评价的间接方法［12］。这种方法是以人群家系结构与某些表型表达的相关性为基础的。例如，北欧人的皮肤色素沉着比其他地区的人更浅，利用合适的数据库可以定义不同区域人群的皮肤色素沉着程度，并将其作为始祖起源参照，则浅肤色的证据样本可以定位在北欧地区。

这种始祖基因测试已经在2003年成功应用于美国路易斯安那州连环杀人案的调查。证物的AIMs分析结果指出，犯罪嫌疑人为非裔的可能性为85%，因而间接推测出犯罪嫌疑人为深色皮肤，为调查提供了线索。

2.2.4 在推测不同个体表型特点中的应用 AIMs可以提供关于犯罪嫌疑人外表的有用信息，它们是间接传递生物地理家系个体表型的唯一方式，但在描述个体外表的价值上是有限的，而且要根据具体案例情况考虑其应用的价值［12］。描述表型特点的DNA标记要能进行更加准确的外表遗传学预测，从而识别犯罪者。在人类学研究中，它们对利用人体遗物进行面部重构具有重要价值。作为直接的方法，它需要评估显著影响特殊表型的基因变异并开发与特殊表型相关的基因变异的数据库。个人外表最明显的标记是肤色、身高和面部特征，它们都是有高度遗传性的。因此，测定SNPs是可行的，而且对预测不同表型特点有重大意义。

大量色素基因中的SNPs与各种人群头发、皮肤和眼睛颜色的表型相关。头发、皮肤和眼睛颜色的遗传基础在动物模型上已经得到很好的解释，但目前为止关于表型SNPs的主要工作仍集中在色素沉着上。迄今为止，对于很多色素沉着复杂多基因特性的遗传基础已经成功阐述，为其他高遗传性状成因的SNPs的研究提供了希望，如身高和面部形态基因的应用将成为可能。

2.2.5 在某些案件中的独特应用 与常染色体遗传标记相比，对轮奸案、强奸案等案件提取的混合检材进行鉴定时，Y染色体遗传标记扩增分型技术更有其特殊的价值，获得的单倍型结果不受女性成分影响。文献［13-14］报道将男性与女性的血液混合提取DNA，对模板进行Y-SNPs位点的复合检验，发现男女成分比例为1 000∶1时仍能得到正确分型，不受女性成分的影响。当犯罪嫌疑人样本无法获得时，还可通过取其父系的任何一个男性个体的生物检材作Y染色体遗传标记进行排查分析，达到节约费用，缩小排查范围的目的。

另外，Y染色体SNPs分布具有明显的地域性，可用于进行犯罪现场遗留的生物学个体所属群体的推断。这将为法医案件侦破提供新的研究思路。

3 存在的问题

通过上述的研究内容可知，SNPs用于法医学具有可行性，而且具有其独特的优势，但目前SNPs检验在法医学领域实际应用中还存在诸多需要解决的问题。

（1）已有的大量研究表明，从生物检材中检验有用的SNPs要比人们想象的困难得多。

（2）虽然Y-SNPs作为新一代遗传标记，在法医学领域有良好的应用前景，但是Y-SNPs的多态性远远低于Y-STR，因此建立一个适合法医学应用的多态性高、稳定性好的Y-SNPs复合检验体系需要更多的Y-SNPs位点，实验难度大，且在实验过程中存在检验步骤繁琐、耗时长、过于敏感等，可能会得到假阳性、阴性结果。

（3）在SNPs检验技术方面，DNA芯片技术目前在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等各个环节仍然存在着许多难以解决的问题，加之基因芯片技术对特殊仪器的依赖，技术成本昂贵、复杂，限制了其实际应用；MALDITOFMS技术则耗费过高，设施要求高，国内许多实验室还无法开展；另外，高通量SNPs筛查所需技术虽然自动化程度高，但费用要比STR检验高，目前条件下大批量扩增和检验所产生的错误率过高，这也是阻碍其推广使用的原因之一。

（4）世界上各种族和民族间的差异较大，每一SNPs在不同的人群可能会有不同的价值，因此，当SNPs用于法庭科学时，需调查不同种族和民族的SNPs多态性频率。Kidd K K等［11］认为只有1／3的SNPs可用于群体遗传学，而不像STR位点已经获得大量的各种族和民族多态性频率资料，能成熟地应用于法医个体识别和亲权鉴定。我国这一工作仍处于起步阶段。

（5）由于目前对于Y-SNPs的检验尚未建立稳定的、适合亲权鉴定的复合体系，因此，国内尚未见将Y-SNPs应用于亲权鉴定案例的报道，这将是法医DNA分析的一个研究方向。

总之，SNPs应用要想在国内普及开来，以至于取代STR成为新一代的法医物证的核心，还需在许多方面做进一步研究和大量的工作。但是，SNPs标记在法医学样本分析的一些特殊领域将会发挥巨大的作用。如分析高度降解的检材、提高亲缘关系和家系重建的能力用于走失人口的鉴别等，同时也能为一些案件的调查提供重要线索。身份鉴定SNPs可能会最先应用于日常工作，然后是系谱SNPs。SNPs个体生物地理起源推测和个体表型的推测将会应用在更为专业的领域，成为提供案件调查线索的一种新思路。

［1］ Marshall E.The hunting of the SNPs［J］.Science，1997，278：2046.

［2］ 孙宏钰，伍新尧.SNPs多态性及其法医学应用［J］.中国法医学杂志，2001，16（2）：123-126.

［3］ Delahunty C，Ankener W，Deng D，et al.Testing the feasibility of DNA typing for human identification by PCR and anoligo nucleotide ligation assay［J］.Am J Hum Genet，1996，58（6）：1239.

［4］ Housman D，Ledley F D.Why pharmacogenomics？Whynow？［J］.Nat Biotechnol，1998，16：492.

［5］ 张爱平，刘 超，刘长晖.Y染色体SNPs及其在法医学中的应用［J］.刑事技术，2009（5）：32-34.

［6］ 伍新尧，罗超权，杨英浩.基因诊断原理与临床［M］.广东广州：中山大学出版社，1995：38.

［7］ Li J，Butler J M ，Tan Y P，et al.Single nucleotide polymorphism determination using primer extension and time-of-flight mass spectrometer［J］.Electrophoresis，1999，20：1258.

［8］ Holloway J W，Beghe B，Turner S，et al.Comparison of three methods for single nucleotide polymorphism typing forDNA bank studies：sequence-specific oligonucleotide probehybridization，TaqMan liquid phase hybridization and microplate array diagonal gel electrophoresis（MADGE）［J］.Hum Mutat，1999，14（4）：340.

［9］ 应斌武，高玉振，张建华，等.Y-染色体SNPS及其在法医学中的应用价值［J］.法医学杂志，2002，18（4）：246-248.

［10］ Sanchez J J，Phillips C，BΦrsting C，et al.A multiplex assay with 52single nucleotide polymorphisms for human identification［J］.Electrophoresis，2006，27：1713-1724.

［11］ Kidd K K，Pakstis A J，Speed W C，et al.Developing，a SNP panel for forensic identification of individuals［J］.Forensic Sci Int，2006，164：20-32.

［12］ 景晶晶，李 潭.法医学相关SNP的分类［J］.辽宁警专学报，2009，58（6）：61-63.

［13］ 杜 宏，张 林，周 斌.微测序技术检验12个Y-SNPs及其遗传多态性［J］.法医学杂志，2006，22（2）：125-129.

［14］ Onofri V，Alessandrini F，Turchi C，et al.Development of multiplex PCRs for evolutionary and forensic applications of 37human Y chromosome SNPs［J］.Forensic Sci Int，2006，157（1）：23-35.