洛伐他汀对TNF－α诱导人脐静脉内皮细胞MCP－1和IL－10表达的影响

赵铁柱，沈 焕，陶致侃，王 为，赵丹丹

（沈阳医学院沈洲医院血管外科，辽宁 沈阳 110032）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种多因素疾病，是血管内皮损伤导致的过度炎症反应性血管疾病。AS的病因包括内皮损伤、脂质代谢异常、血流动力学损伤、遗传和物理化学损伤等，而多种复杂因素网络交叉样作用于血管壁，其结果是血管壁的慢性炎症，是对血管壁损害的反应和修复过程［1］。炎症反应贯穿于AS的启动、形成和发展以及不稳定斑块，在AS的发生和发展过程中扮演着极为重要的角色［2］。目前，慢性炎症学说的研究主要集中于炎性细胞、各种细胞因子及免疫机制的交互作用［3－4］。粥样斑块内单核细胞的黏附、迁移和浸润，是引起AS的主要原因［5］。单核细胞的活性主要由趋化因子，如单核细胞趋化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）调节，MCP－1是一种内皮细胞分泌的促炎性细胞因子，大量的研究［6］也表明：单核细胞的趋化主要是由MCP－1来实现，在动脉粥样硬化发展中的作用十分重要。实验［7］证明：MCP－1可促使进入血管壁的单核细胞转变为巨噬细胞，吞噬大量修饰的脂蛋白，形成泡沫细胞。活化的白细胞和血管壁本身的细胞还可以释放多种生长因子，促进血管平滑肌细胞的增生和向内膜下迁移，最终形成AS病变。核因子NF－κB可调控AS斑块炎症反应中MCP－1的转录表达。此外，作为重要的促炎症细胞因子，肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）存在于AS斑块形成和破裂的过程中［2，5］。研究［5］表明：TNF－α与内皮细胞胞膜上的TNF受体（TNFR）相结合，发挥生物学效应，从而诱导内皮细胞的衰老和凋亡。血管内皮细胞在受刺激后，产生明显的病理和生理学变化，从而启动局部的炎症反应和粥样斑块的形成［8］。同时，炎症介质白细胞介素10（IL－10）对慢性血管炎症有重要影响。IL－10是重要的炎症调控因子，具有抗炎和免疫调节作用，IL－10在AS病变形成和稳定方面发挥重要功能，是AS的保护因子。在人AS发生过程中IL－10的表达上调，提示除了致炎因子外，抗炎因子如IL－10等也参与了AS的发生［9］。近年来，在AS的抗炎治疗中，他汀类药物具有重要的抗炎作用，能够减少内皮对炎症细胞的吸附作用，减少斑块内的炎性细胞浸润，抑制血小板聚集［4，10］。因此早期应用他汀类药物成为关注的热点。结合相关文献报道以及本课题组前期工作基础，本研究采用TNF－α刺激内皮细胞模拟炎症条件，通过对MCP－1、IL－10和NF－κB等炎症相关因子的研究，探讨洛伐他汀（lovastatin，LVT）保护人脐静脉内皮细胞（HUVECs）功能的作用，阐明LVT抗炎的可能机制，为AS的抗炎治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 HUVECs（中国科学院上海细胞所）。LVT（产品批号：75330－75－5，粉剂，20mg，上海纯优生物科技有限公司）；2′，7′－二氯氢化荧光素二酯（20，70－dichlorofluorescin diacetate，DCFH－DA）（美国Sigma公司）；胎牛血清（FBS，美国Hyclone公司）；RPMI 1640培养基和胰蛋白酶（美国Gibco公司）；Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen Life Technologies公司）；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量测定试剂盒和MCP－1、IL－10单克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（美国Santa Cruz公司）。ABI 7500Fast Real－Time PCR仪（美国ABI公司）；Bio－rad 680酶标仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直电泳槽和转移电泳槽（美国Bio－Rad公司）。

1.2 HUVECs培养 在无菌条件下，细胞常规培养于含10%FBS的RPMI 1640培养液中，含青、链霉素双抗（1%）。在37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养。实验采用第2～4代细胞，待细胞生长融合成单层后进行实验。

1.3 细胞分组及干预 用含10%FBS的RPMI 1640培养液在37℃、5%CO2的细胞培养箱内培养18h，待细胞融合成单层后，分为对照组、TNF－α处理组和LTV干预组。对照组细胞仅用含10%FBS的RPMI 1640培养液培养；TNF－α处理组细胞用含10%FBS的RPMI 1640培养液＋TNF－α（20μg·L－1）处理；LVT干预组，用含10%FBS的RPMI 1640培养液＋TNF－α（20μg·L－1）＋LVT（10μmol·L－1）处理（加入LVT 1h后加入TNF－α）。每组均设5个复孔，培养24h后收集细胞。

1.4 活性氧（ROS）含量测定 参照说明书，各组细胞分别培养预定时间后，用0.125%胰酶∶0.02%EDTA按1∶1比例的混合液消化细胞，无血清的培养基洗2次，重悬于PBS中。调整细胞数至每升4×108个细胞。加入DCFH－DA（无水乙醇配置）1μL，避光，置于37℃水浴30min。流式细胞术检测荧光强度（激发光波长488nm，发射光波长530nm）。每次获取1.5×104个细胞，采用BD公司的Sinmul SET软件进行测定及分析，结果取5次的平均值。

1.5 实时定量RT－PCR检测MCP－1和IL－10 mRNA表达水平 用Trizol提取总RNA，逆转录，应用SYBR荧光定量PCR方法测定mRNA的表达。使用ABI 7500Fast Real－Time PCR System两步法PCR标准程序扩增：95℃变性30s（95℃变性30s、60℃退火30s）×40个循环。本实验以GAPDH作为内参照，引物由大连宝生物工程有限公司合成。内参GAPDH引物序列：上游引物5′－AACGGATTTGGTCGTATTG－3′，下游引物5′－GCTCCTGGAAGATGGTGAT－3′，产物长度为214bp；MCP－1引物序列：上游引物5′－TGCCGCCCTTCTGT－3′，下游引物5′－TTGGGTTTGCTTGTCC－3′，产物长度为274bp；IL－10引物序列：上游引物5′－AGCCTACATGACAATGAAGA－3′，下游引物5′－GGTTGAGGTATCAGAGGTAAT－3′，产物长度为180bp。采用2－△△CT法进行计算，计算公式：①改变的倍数＝2－ΔΔCT；②ΔΔCT＝（CT靶基因－CT内参）处理组－（CT靶基因－CT内参）未处理组。

1.6 Western blotting法检测MCP－1、IL－10和磷酸化NF－κB蛋白表达水平 收集各组HUVECs后加入预冷的细胞裂解液，收集蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。以40μg总蛋白上样，经SDSPAGE电泳，然后转膜。加入1∶500的兔抗人MCP－1、IL－10和磷酸化NF－κB（p65NF－κB）一抗稀释液，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，再加入HRP标记的羊抗兔二抗稀释液（1∶10000），置室温2h显色。光密度分析软件处理分析。

1.7 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，蛋白表达灰度值、基因表达水平以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 ROS测定结果 对照组、TNF－α处理组和LVT干预组的ROS含量分别为310.01±93.26、659.81±92.57和401.11±83.08。与对照组比较，TNF－α处理组ROS含量明显增高（P＜0.05）；与TNF－α处理组比较，LVT干预组ROS含量明显降低（P＜0.05）。

2.2 MCP－1和IL－10mRNA表达水平 TNF－α作用于HUVEC后，TNF－α处理组细胞中MCP－1 mRNA表达（1.42±0.11）明显高于对照组（0.99±0.12）和LVT干预组（1.11±0.09），差异有统计学意义（P＜0.05）；而TNF－α处理组中IL－10 mRNA表达（0.61±0.05）明显低于对照组（0.99±0.17）和LVT干预组（0.81±0.08），差异有统计学意义（P＜0.05）；与TNF－α处理组比较，LVT干预组MCP－1mRNA表达降低（P＜0.05），IL－10 mRNA表达增加（P＜0.05）。

2.3 MCP－1、IL－10和p65NF－κB蛋白表达水平TNF－α作用于HUVECs后，TNF－α处理组细胞中的MCP－1蛋白和p65NF－κB蛋白表达明显高于空白对照组和LVT干预组（P＜0.05），而IL－10蛋白表达明显低于对照组和LVT干预组（P＜0.05）；与TNF－α处理组比较，LVT干预组MCP－1和p65NF－κB蛋白表达降低（P＜0.05），IL－10蛋白表达增加（P＜0.05）。见图1和表1。

3 讨 论

在AS斑块形成过程中，炎症反应是其主要特征并起着关键性的作用，各种炎性介质和抗炎因子相互作用决定着斑块的形成速度和稳定性［11］。单核巨噬细胞系统特别是与单核巨噬细胞浸润有关的因子，对于AS形成至关重要。MCP－1是属于趋化因子类细胞因子，是一种特异性单核细胞趋化因子。人类MCP－1基因位于17号染色体含有3个外显子和2个内含子，编码99个氨基酸残基的蛋白质。成熟、有活性的MCP－1由76个氨基酸构成，最前的23个氨基酸残基具有疏水性，是一种信号肽的典型表现。MCP－1通过与单核细胞表面的趋化因子受体2（CCR2）结合，使血液中的单核细胞迁入血管内膜下，并活化为巨噬细胞，摄取已进入内膜并发生修饰的脂蛋白形成单核细胞源泡沫细胞，促使AS的形成，而且能促进血管壁平滑肌细胞（SMC）的增殖［12］，在AS的早期起重要作用［13］。MCP－1已经被认为是AS起始炎症过程的关键因子。

图1 各组HUVECs中MCP－1、IL－10和p65NF－κB蛋白表达Fig.1 Expressions of MCP－1，IL－10，and p65NF－κB protein in HUVECs in various groups

表1 各组HUVECs中MCP－1、IL－10和p65NF－κB蛋白表达Tab.1 Expression levels of MCP－1，IL－10and p65NF－κB in HUVECs in various groups（n＝5，）

表1 各组HUVECs中MCP－1、IL－10和p65NF－κB蛋白表达Tab.1 Expression levels of MCP－1，IL－10and p65NF－κB in HUVECs in various groups（n＝5，）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with TNF－αtreated group.

GroupMCP－1／β－actin IL－10／β－actin p65NF－κB／β－actin Control 0.45±0.0410.91±0.0870.56±0.049 TNF－αtreated 0.67±0.051＊0.52±0.051＊1.02±0.081＊LVT treated 0.44±0.036△0.61±0.054△0.37±0.026△

内皮细胞是防止AS的第一道防线，内皮细胞损伤或功能障碍被认为是AS的始发因素，与AS之间的关系日益受到重视。内皮细胞对血循环和动脉壁局部的微环境变化敏感，如氧化应激、炎症等，从而调节一些能影响血管壁功能的分子的表达和活性。

他汀类药物又名羟甲基戊二酸单酰辅酶A（hydroxy－methylglutaryl coenzyme A，HMG－CoA）还原酶抑制剂，体内外研究提示：他汀类药物有一定的抗炎作用，可抑制SMC增殖、改善血管内皮的功能、抑制细胞凋亡和降低患者C反应蛋白等。

本研究发现：在TNF－α刺激下HUVECs中MCP－1mRNA和蛋白表达增高。同时在TNF－α刺激下，NF－κB蛋白表达水平增高，而NF－κB是炎症的核心调节因子，AS的炎症反应过程所涉及的许多基因都是由NF－κB激活。TNF－α刺激HUVECs增加ROS含量，而ROS也可通过活化转录因子NF－κB上调MCP－1表达［5］。在LVT的干预下，可下调MCP－1mRNA和蛋白的表达以及降低ROS含量，这说明LVT能够抑制炎症因子TNF－α所诱导的MCP－1高表达，因而可能减轻MCP－1对HUVECs的炎性损伤，同时也降低了ROS本身所带来的损伤作用，从而起到保护内皮细胞的作用。

在人AS发生过程中IL－10的表达上调，提示除了致炎因子外，抗炎因子如IL－10等也参与了AS的发生，是AS的保护因子［14］。IL－10是重要的炎症调控因子，具有抗炎和免疫调节作用。王飞等［15］研究发现：IL－10对趋化因子MCP－1表达有显著的抑制作用。同时发现IL－10能抑制泡沫细胞中氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）导致的NF－κB活化，表明IL－10对趋化因子的抑制作用部分是对NF－kB活性的抑制而达到，从而降低趋化因子mRNA转录及蛋白合成。临床研究［16］发现：在AS患者中如血清中IL－10浓度偏高者，其病程及预后较好。本研究发现：TNF－α刺激下HUVECs中IL－10mRNA和蛋白表达水平均降低，而在LVT干预下IL－10mRNA和蛋白表达水平有所增高，但NF－κB的表达水平降低。说明LVT可能通过增加IL－10的表达、降低NF－κB的表达而起到保护内皮细胞的作用。

综上所述，LVT可能通过降低MCP－1的表达和ROS含量同时增高IL－10的表达，保护内皮细胞，这些作用可能通过对NF－κB的调节而实现。因此，LVT对AS的形成和发展能够起到抑制作用。

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