20（s）－原人参二醇对体外培养宫颈癌Siha细胞的增殖抑制作用及其机制

鲁育铭，赵丽晶，王贺彬，许 多，赵丽娟，董 妍

（1.吉林大学白求恩医学院病理生理学教研室，吉林 长春 130021；2.美国杜兰大学细胞生物学教研室，美国 新奥尔良 LA70062）

在发展中国家，子宫颈癌约占女性癌症的24%［1］。人参的主要生物活性成分为人参皂苷，研究［2－3］表明：人参皂苷经机体代谢所产生的次级皂苷——20（s）－原人参二醇（proto－panaxdiol，PPD）具有抗肿瘤活性，可抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化，促进肿瘤细胞凋亡。本课题组前期研究［4－6］结果显示：PPD可诱导体外培养的Siha细胞发生凋亡和自噬，而PPD对体外培养Siha细胞周期影响的研究尚未见报道。为了进一步阐述PPD的抗肿瘤作用，本实验通过检测PPD对人宫颈癌Siha细胞p53、p21及细胞周期素E（cyclin－E）基因表达的影响，进一步探讨PPD对Siha细胞增殖抑制作用的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 Siha细胞购自协和医科大学。PPD由吉林大学化学学院有机化学教研室制备，乙醇溶解。IMDM培养液和胎牛血清购自美国Hyclon公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 Siha细胞的培养与传代 Siha细胞于含10%胎牛血清的IMDM培养液中，于37℃、5%CO2孵箱中培养，采用0.25%胰酶消化传代。

1.3 流式细胞术检测Siha细胞周期 将生长状态良好的处于静止期Siha细胞分为阴性对照组和实验组，分别用等体积的乙醇和20μg·L－1PPD处理48h后收集细胞，1000r·min－1离心5min，用冷PBS清洗2次，弃上清，向细胞沉淀中加入70%冷乙醇，4℃固定12h，PBS清洗2次去除乙醇，RNase消化后，加入1.5mL PI（0.5mg·L－1）染色，过滤，混匀后行流式细胞仪检测，ModFit LT软件分析结果，实验结果以Siha细胞各期细胞比例表示。

1.4 Real time PCR法检测Siha细胞中p53、p21和cyclin－E mRNA表达水平 分别用等体积的乙醇和20μg·L－1PPD处理Siha细胞48h后，使用Trizol提取RNA，逆转录为cDNA，进行PCR反应。p53，上游引物：5′－CCATCTACAAGCAGTCACAG－3′，下游引物：5′－CCAAATACTCCACACGCAA－3′；p21，上游引物：5′－TGAGTTGGGAGGAGGCA－3′，下游引物：5′－AGCGAGGCACAAGGGTA－3′；Cycline－E，上游引物：5′－CTGGATGTTGACTGCCTTGA－3′，下游引物：5′－CCGCTGCTCTGCTTCTTAC－3′；GAPDH，上游引物：5′－GAAGGTGAAGGTCGGAGTC－3′，下游引物：5′－GAAGATGGTGATGGGATTTC－3′。反应条件：94℃、5min退火，94℃、30s，58℃、30s，72℃、45s，共30个循环，在延伸阶段收集荧光数据。以GAPDH为内参照，用PCR仪自带的SDS软件（v1.4）收集数据。p53、p21和cyclin－E mRNA的表达水平采用2—△△Ct法计算。

1.5 Western blotting法检测Siha细胞中P53、P21和Cyclin－E蛋白表达水平 Siha细胞分别用乙醇和20μg·L－1PPD处理48h后，用PBS洗3次，用蛋白刮将细胞刮下，超声裂解细胞，12000r·min－1离心40min，取上清蛋白溶液，蛋白定量后取45μg蛋白加入5×SDS－PAGE上样缓冲液，100℃煮沸5min，12%SDS－PAGE电泳分离，100V转膜1.5h，用3%BSA的TBST封闭，TBST洗膜，依次加入一抗、二抗进行免疫结合，AP显色。以β－actin为内参照，计算相对光密度（A）值。目的蛋白的A值＝（目的蛋白条带光强度×平均光密度）／（同一样品β－actin条带光强度×平均光密度）。实验重复3次，计算各组A值。以目的蛋白的A值间接表示蛋白表达水平。A值越大，蛋白表达水平越高。

1.6 统计学分析 采用SPSS 10.0软件对数据进行分析处理。细胞周期比例、mRNA表达水平和目的蛋白A值均以表示，两组间样本均数比较采用t检验。

2 结 果

2.1 流式细胞术检测Siha细胞各周期的分布20μg·L－1PPD处理48h后，与阴性对照组比较，实验组G1期细胞比例明显增加（P＜0.01），S期细胞比例明显降低（P＜0.01），G2期细胞比例无明显差异（P＞0.05）。实验组与阴性对照组各期细胞比例见表1和图1（插页三）。

表1 各组Siha细胞不同细胞周期比例Tab.1 Proportions of Siha cells at different cell cycle in various groups［n＝3，η／（）%］

表1 各组Siha细胞不同细胞周期比例Tab.1 Proportions of Siha cells at different cell cycle in various groups［n＝3，η／（）%］

＊P＜0.01 vs control group.

GroupProportion of Siha cells G1S G2 Control 40.1±4.128.6±2.532.4±3.7 PPD 46.7±4.5＊21.0±2.9＊31.5±3.2

2.2 Real time PCR法检测Siha细胞中p53、p21和cyclin－E mRNA表达水平 与对照组（1）比较，实验组Siha细胞中p53mRNA表达水平增加至（2.93±0.26）（P＜0.01），p21mRNA表达水平增加至（2.31±0.17）（P＜0.01），cyclin－E mRNA表达水平降低至（0.25±0.03）（P＜0.01）。

2.3 Western blotting法检测Siha细胞中P53、P21和Cyclin－E蛋白表达水平 与对照组比较，实验组Siha细胞内P53、P21蛋白表达水平显著增加（P＜0.01），Cyclin－E蛋白表达水平显著减少（P＜0.01）。见表2和图2。

表2 Western boltting法检测各组Siha细胞中P53、P21和Cyclin－E蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of P53，P21，and cyclin－E in Siha cells in various group detected by Western blotting method（）

表2 Western boltting法检测各组Siha细胞中P53、P21和Cyclin－E蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of P53，P21，and cyclin－E in Siha cells in various group detected by Western blotting method（）

＊P＜0.01 vs control group.

Group P53P21Cyclin－E Control 0.43±0.010.42±0.031.920±0.160 PPD 1.93±0.04＊3.33±0.11＊0.880±0.001＊

图2 Siha细胞中P21、P53及Cyclin－E蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expressions of P21，P53and Cyclin－E in Siha cells

3 讨 论

细胞周期调控异常是肿瘤发生的内在原因，在细胞周期中，G1／S、G2／M期的调控点是细胞内外信号经过传递、整合汇集到细胞核，对细胞的增殖进行调控的关键点，该点调控的异常与肿瘤的发生发展关系密切［7］。正常情况下，当细胞受损时，通过激活调控点，导致G1期和G2期延长，使细胞有时间完成复制前和有丝分裂前的修复，以保证细胞正常存活，当损伤超出细胞的修复能力，则促使细胞凋亡［8］。本研究结果显示：20μg·L－1PPD处理48h后，实验组G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例明显降低，G2期细胞比例无明显变化，提示PPD可使Siha细胞G1／S调控点的调控作用增强，G1期相对延长。

细胞周期过程中，P53蛋白可作为转录因子或与其他转录因子结合，直接或间接影响细胞周期相关基因的转录，使细胞滞留在G1期［9］。p53基因可被细胞活动中多种有害因素所激活，而DNA损伤与癌基因的表达是p53基因激活的主要刺激因素［10］。p53基因激活后可作用调控p53下游的p21，共同调整细胞周期［11］。虽然p53抑癌作用的分子机制还未得到完全证实，但其在细胞周期中的抑制作用被广泛接受［12］，其是迄今为止发现与人类肿瘤细胞的发生高度相关的基因［13］。本实验结果显示：PPD处理后，Siha细胞p53mRNA及蛋白表达水平上调，提示PPD诱导的Siha细胞G1／S调控点调控作用改变可能是通过p53的表达上调而实现。

研究［14］发现：野生型p53可调控p21的转录。p21基因是调控细胞周期的相关基因，属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子的cip／kip家族，其第21～26及49～72个氨基酸处分别与Cyclin和CDK结合，从而使cyclin－CDK复合物的激酶活性丧失，进而对细胞周期进行负调控［15］。本研究结果显示：PPD处理后Siha细胞p21基因转录及蛋白表达水平上调，表明p53上调了p21mRNA及蛋白的表达水平。

Cyclin－E是G1期特异性蛋白，其表达升高始于G1中期，至G1晚期的G1／S交界处达到高峰，后随细胞进入S期并开始下降，至G2／M期降为零。Cyclin－E在细胞由G1向S期进展中起重要作用，其与细胞周期蛋白依赖性激酶2（Cdk2）形成活性复合物Cyclin－E／CDK2参与G1期和S期的pRb磷酸化作用，可使细胞增殖加快［16－17］。本研究结果显示：PPD处理后Siha细胞cyclin－E mRNA及蛋白表达水平下调，表明p21进一步抑制了cyclin－E基因的转录与表达。

本研究为了进一步阐述PPD对体外培养siha细胞增殖抑制作用的机制，利用流式细胞术检测了细胞周期，利用Real time PCR和Western blotting法检测p53、p21及cyclin－E基因转录和蛋白表达的改变，结果显示：PPD处理后Siha细胞G1期细胞比例明显增加，G2期细胞比例保持不变；p53、p21基因的转录和表达显著增强；cyclin－E基因的转录和表达明显下调。以上结果提示：PPD可能通过增加p53的表达，上调p21基因的转录，p21基因进一步抑制cyclin－E，从而延长细胞的G1期，进而抑制Siha细胞的增殖。关于PPD抑制Siha细胞增殖的具体机制还有待进一步研究。

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