阿托伐他汀对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌酶和心肌细胞凋亡的影响及其心肌保护作用机制

黄可欣，石 博，叶保国，宋雪松

（1.吉林大学白求恩医学院形态学中心，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 130021）

他汀类药物，即3－羟－3－甲基戊二酰辅酶A（HMG－CoA）还原酶抑制剂，可特异性作用于胆固醇合成的限速酶，抑制胆固醇的合成，并增强低密度脂蛋白（LDL）受体的活性，进而加快血清中LDL－C的清除［1］。国内外的研究［2－3］证实：他汀类药物在心血管保护方面具有多效性，有着许多独立于降脂外的作用，包括抗氧化、改善血管内皮功能、降低血管炎症反应、抑制平滑肌增殖和免疫调节等。对缺血心肌施行再灌注治疗是缺血性心脏病的主要治疗方法之一，而伴随的缺血再灌注（I／R）损伤成为影响疗效的一个重要因素。近年来国内外有研究［2－3］报道：他汀类药物能够减少I／R损伤，对心血管起到保护作用。本实验通过观察I／R损伤大鼠心肌酶学的变化及Fas、Bax和Bcl－2心肌细胞凋亡基因的表达，揭示阿托伐他汀（atorvastatin，AT）对I／R损伤大鼠心肌保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 健康雄性Wistar大鼠80只，体质量（240±10）g，由吉林大学白求恩医学部动物实验中心提供（动物许可证号：SCXK2007－吉大－0003）；AT由大连辉瑞制药有限公司提供，实验时用生理盐水稀释；磷酸肌酸激酶（phosphocreatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）及谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠Fas多克隆抗体、兔抗鼠Bax多克隆抗体和兔抗鼠Bcl－2多克隆抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供；SP9710检测试剂盒及DAB显色试剂盒由福州迈新生物有限公司提供。

1.2 I／R模型的制备 采用利多卡因腹腔麻醉后，将大鼠固定于解剖台，颈部消毒，行颈前正中切口暴露气管，经口腔用8号灌胃针头进行气管插管并接动物呼吸机（呼吸频率60～80min－1，潮气量7～9mL）。用脱毛膏脱去胸毛，碘伏消毒。于左侧第三或第四肋间打开胸腔，轻压将心脏挤出胸腔，剪开心包，以冠状动脉主干为标志，左心耳根部下方2mm处，在左冠状动脉前降支（left anterior descending artery，LAD）面放置一小硅胶管连同冠脉用无创伤缝合线一起结扎，造成左心室室壁缺血。迅速将心脏送回胸腔，医用缝合线的两端留置体外备用。用长嘴止血钳将胸部皮肤和肌肉以及心脏挂线夹紧，防止发生气胸。30min后，放松挂线，抽出硅胶管，形成再灌注模型。造模结束时，逐层缝合肌肉、皮肤，切口处注入少许青霉素注射液，再次碘伏消毒，预防感染［5］。

1.3 实验动物分组及造模前准备 动物适应性喂养1周后，随机分为4组：假手术组（S组），仅穿线，不结扎LAD；缺血再灌注组（I／R组），于结扎LAD前30min右颈静脉注射等容量生理盐水，结扎30min后松扎，再灌注120min；大剂量AT组（LAT组），于结扎LAD前30min于右颈静脉注射AT 10mg·kg－1，结扎30min后松扎，再灌注120min；小剂量AT组（SAT组），于结扎LAD前30min于右颈静脉注射AT 1mg·kg－1，结扎30min后松扎，再灌注120min。

1.4 大鼠心肌梗死面积的检测 大鼠心肌I／R 120min后，每组取10只大鼠，摘取心脏，行TTC染色明确未梗死与梗死心肌。未梗死区红染、梗死区染为白色，采用Motic Images Advanced 3.2图像分析软件测量。心肌梗死面积（%）＝（梗死区心肌面积／整个心肌面积）×100%。

1.5 大鼠血清心肌酶学的检测 大鼠心肌缺血再灌注120min后，于眼眶采血1mL，以3000r·min－1离心10min，分离得大鼠血清，按试剂盒说明书进行CK、LDH、NO、SOD、MDA、GSH和GSH－Px表达水平的检测。

1.6 SP免疫组织化学染色法检测Fas、Bax和Bcl－2蛋白的表达 处死动物，取心肌组织，石蜡包埋，切片厚度为4μm，根据试剂盒说明检测大鼠心肌组织Fas、Bax和Bcl－2蛋白的表达，采用Motic Images Advanced 3.2图像分析软件测得大鼠心肌组织Fas、Bax和Bcl－2蛋白的灰度值，阳性表达越高灰度值越低，阳性表达越低灰度值越高。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。心肌梗死面积和血清CK、LDH、NO、SOD、MDA、GSH、GSH－Px数据及大鼠心肌组织Fas、Bax、Bcl－2蛋白的灰度值数据均以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积 与假手术组比较，I／R组大鼠的心肌梗死面积（80.31%±5.73%）明显增大（P＜0.01）；与I／R组比较，LAT组和SAT组大鼠心肌梗死面积（16.15%±2.46%，20.21%±3.27%）明显减小（P＜0.01），而LAT组与SAT组间心肌梗死面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组大鼠心肌酶学检测结果 与S组比较，I／R组大鼠血清中CK、LDH和MDA表达水平升高（P＜0.01），而NO、SOD、GSH－Px和GSH活性降低（P＜0.01）。与I／R组比较，LAT和SAT组大鼠血清CK、LDH及MDA活性明显降低（P＜0.01），血清NO水平、SOD活性、GSH－Px活性和GSH含量明显升高（P＜0.01），LAT组和SAT组各项指标组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠心肌组织中Fas、Bax和Bcl－2蛋白的表达水平 与S组比较，I／R组、LAT组和SAT组大鼠心肌组织Fas和Bax蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与I／R组比较，LAT组和SAT组大鼠心肌组织Fas蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01），LAT组和SAT组大鼠心肌组织Bax蛋白的表达水平与I／R组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与S组比较，I／R组、LAT组和SAT组大鼠心肌组织Bcl－2蛋白的表达水平升高，其中LAT组大鼠心肌组织Bcl－2蛋白的表达明显高于S组（P＜0.01），而其他各组间Bcl－2蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2及图1～3（插页四）。

表1 各组大鼠血清中CK、LDH、MDA、NO、SOD、GSH－Px和GSH表达水平Tab.1 Expression levels of serum CK，LDH，MDA，NO，SOD，GSH－Px and GSH of rats in various groups（n＝10，）

表1 各组大鼠血清中CK、LDH、MDA、NO、SOD、GSH－Px和GSH表达水平Tab.1 Expression levels of serum CK，LDH，MDA，NO，SOD，GSH－Px and GSH of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.01compared with S group；△P＜0.01compared with I／R group.

80.22±7.64407.19±12.61241.23±8.77 I／R 9.03±1.12＊3.01±0.46＊7.11±1.32＊30.12±4.75＊180.34±5.06＊325.14±10.12＊183.56±7.73＊LAT 3.86±0.49△0.48±0.06△4.01±0.83△43.91±4.18△262.74±8.21△389.23±9.45△230.19±4.38△SAT 4.03±1.08△0.51±0.07△4.34±1.26△39.87±5.09△258.36±9.15△371.39±8.42△219.57±7.18）］S 0.45±0.030.21±0.013.62±0.5846.35±5.712 GroupCK［λB／（U·mL－1）］LDH［λB／（U·mL－1）］MDA［λB／（U·mL－1）］NO［cB／（mmol·L－1）］SOD［λB／（U·mL－1）］GSH－Px［λB／（U·mL－1）］GSH［ρB／（mg·L－1△

表2 各组大鼠心肌组织中Fas、Bax和Bcl－2蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of Fas，Bax，and Bcl－2proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝10，）

表2 各组大鼠心肌组织中Fas、Bax和Bcl－2蛋白表达水平Tab.2 Expression levels of Fas，Bax，and Bcl－2proteins in myocardium tissue of rats in various groups（n＝10，）

＊P＜0.01compared with S group；△P＜0.01compared with I／R group.

Group Fas Bax Bcl－2 S 170.32±8.53148.18±4.91148.57±6.13 I／R 84.55±4.26＊95.23±4.08＊136.45±5.26 LAT 120.71±6.29＊△113.85±3.94＊90.67±3.51＊SAT 117.38±5.48＊△107.29±5.07＊129.39±3.74

3 讨 论

近年来大量研究［6－7］显示：心肌I／R会进一步加重心肌缺血，心肌功能障碍的程度比急性心肌梗死严重，病死率更高。心肌I／R不可避免地导致心肌损伤，发生心肌缺血和梗死。本实验采用TTC染色区别梗死区和非梗死区，检测心肌梗死的面积，结果显示：与S组比较，I／R组大鼠的心肌梗死面积明显增大，与I／R组比较，LAT和SAT组大鼠心肌梗死面积明显减小，表明AT能缩小心肌梗死范围，保存了更多的存活心肌，其缩小心肌梗死范围机制与其抗氧化应激作用有关联。本研究心肌酶结果提示：与S组比较，I／R组大鼠的血清CK、LDH、MDA表达水平升高，NO、SOD、GSH－Px、GSH表达水平降低；与I／R组比较，AT各剂量组CK、LDH及MDA表达水平明显降低，血清NO、SOD、GSH－Px和GSH表达水平明显升高，LAT组和SAT组各项指标组间比较差异无统计学意义；其心肌酶学指标检测与心肌梗死面积检测结果相符，表明AT对大鼠心肌I／R具有显著的保护作用。

细胞凋亡是主动性细胞死亡形式，动物及人心肌I／R过程均可诱导细胞凋亡［8－9］。有许多因素参与细胞凋亡的调控，其中Fas、Bcl－2和Bax对细胞凋亡的调控倍受重视。Fas蛋白的分子结构由3个部分组成：膜外的N末端区、跨膜区和膜内C端区［10］。Fas主要分布于人活化的T和B淋巴细胞上以及人恶性淋巴细胞上。借助于Fas蛋白发生的细胞凋亡信号的传导，首先需要Fas蛋白交联构型的发生，这种细胞凋亡信号才能进一步传递，并且这种细胞凋亡可发生在无核细胞［11］。本实验结果表明：在大鼠心肌缺血30min，再灌注2h后，I／R组、LAT和SAT组的大鼠心肌Fas蛋白表达水平明显高于S组，提示在细胞凋亡时Fas蛋白是高表达的，LAT组和SAT组的Fas蛋白表达水平明显低于I／R组，表明AT对Fas蛋白表达具有明显的抑制作用。Bcl－2对多种因素引发的细胞凋亡有抑制或延缓作用，其机制可能是通过改变线粒体功能而清除活性氧和自由基，从而减少了活性氧和自由基损伤引起的细胞凋亡［12］。还有研究［13］表明：Bcl－2基因抗细胞凋亡的机制是通过防止受损的DNA激活凋亡的诱导基因来防止细胞凋亡的。本实验结果表明：S组大鼠心肌仅有微量的Bcl－2蛋白表达，而I／R组、LAT和SAT组Bcl－2蛋白表达水平均高于S组，其中以LAT组最为明显，且具有统计学意义，其他各组比较差异无统计学意义，提示AT抗细胞凋亡作用与上调Bcl－2蛋白表达有关。Bax是与Bcl－2结构相似的一种蛋白，但其作用与Bcl－2完全相反，有促进细胞凋亡的作用［14］。Bax通过与线粒体上Bcl－2蛋白形成二聚体发挥作用，当Bax高表达时，形成同源二聚体Bax／Bax促进凋亡，Bcl－2高表达时，形成异源二聚体Bcl－2／Bax抑制凋亡发生，Bcl－2与Bax的比值将决定细胞是否发生凋亡［15］。本次实验结果显示：S组的Bax蛋白仅有微量表达，而I／R组、LAT和SAT组Bax蛋白表达水平均明显地高于S组，表明心肌I／R损伤时Bax是高表达的。而LAT和SAT组与I／R组之间差异无统计学意义，显示AT对Bax无抑制作用。I／R组细胞凋亡的诱导基因Bax、Fas过量表达，最终导致心肌大量细胞凋亡；而LAT组和SAT组Bcl－2蛋白水平明显高于I／R组，Bax蛋白表达水平无显著变化，其中以LAT组最为显著，提示虽然AT没有直接抑制Bax表达，而通过上调Bcl－2蛋白水平而对细胞凋亡起到抑制作用。

综上所述，对心肌I／R损伤模型大鼠，AT能通过减轻心肌酶学的改变、抑制Fas蛋白的表达及促进Bcl－2蛋白的表达，从而对心肌组织起到保护作用。

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