多孔微球在三维细胞培养中的研究进展

张启英，张天柱，胡克，郭兆彬，朱长皓，顾宁

(东南大学生物科学与医学工程学院，江苏省生物材料与器件重点实验室，江苏南京 210009)

体内组织的生长过程是在一定内环境条件下进行的，传统的二维培养［1］并不能够提供组织正常发育所需的环境条件，因而细胞在形态学上会发生改变，进而影响其分化、基因表达等。三维细胞培养作为一种新兴的体外细胞培养技术，既能保留体内细胞微环境的物质基础，又能体现细胞培养的直观性及条件可控性。这种技术能够把体外二维培养与动物模型结合起来，形成一种方便高效的研究体系，并为研究肿瘤的形成及抗肿瘤药物的筛选和组织工程等方面提供重要的平台［2-3］。

近年来随着生物材料领域的发展，用于体外三维细胞培养的支架材料有很多。三维细胞培养支架的主要形式有水凝胶［4］、纤维［5］和多孔结构［6］3 种。多孔微球支架因其高表面积、高效细胞扩增性和可注射性引起广泛关注。这种应用于细胞培养领域的微小球状支架材料又称为“微载体”(microcarrier)，通常由二氧化硅、玻璃、右旋糖苷或其它类似材料制备，用于生物催化剂的固定或是作为贴壁细胞培养的支持体［7］。采用微球的培养方法于1967年首先由Van Wezel［8］提出，当时选用阴离子交换树脂Sephadex A50培养动物细胞并获得成功。与传统细胞培养方法相比，微球培养技术在培养细胞方面具有许多优点，如能提供大的表面积、节省培养空间降低成本、能更好地模拟复杂的生理环境、便于悬浮培养和提高细胞的表型表达等［9-15］，因此是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，并且已经应用于细胞的大量培养中［16-17］。国内外在微载体的开发方面已做了许多工作，并有一些商品化的微载体在科研生产领域中得到应用。因此，作者就对多孔微球的制备、修饰以及其对细胞培养的影响进行综述如下。

1 多孔微球的制备方法

表面及内部具有多孔结构的微球相对于实心或是微囊结构比表面积增加，有利于细胞的大量黏附，开孔结构有利于营养物质的传输和代谢物质的排出以及细胞间的相互作用。目前制备多孔微球的方法主要有乳化分散溶剂挥发法、喷雾干燥法、相分离法［18］、熔融法等，其中最常用的是致孔剂联合乳化分散溶剂挥发法。

1.1 致孔剂联合乳化分散溶剂挥发法

致孔剂联合乳化分散溶剂挥发法是制备多孔微球较简单也是较常用的方法，致孔剂多采用NH3HCO3、蔗糖、NaHCO3、石蜡等。Kim等［19］用复乳有机溶剂挥发法将致孔剂 NH3HCO3加入到内水相中，制备出PLGA多孔微球，微球内部具有多孔结构，孔径与微球直径随着添加NH3HCO3浓度的增高而增大。10%NH3HCO3实验组微球孔径平均为20μm，NIH3T3细胞在微球表面黏附增殖良好，并在种植7 d后可观察到细胞长入微球孔内。Sahoo等［20］用蔗糖作为致孔剂，用复乳有机溶剂法通过调节控制内水相和油相的比例及初乳和外水相的比例，制备出不同粒径和孔径的PLGA和PLA多孔微球，并考察了乳腺癌细胞(MCF-7)在微球支架上的生长情况。结果显示，MCF-7细胞在PLA微球上的黏附增殖明显好于PLGA微球，接种9 d后细胞数增长7倍，并包裹PLA微球形成肿瘤细胞团结构。为构建体外肿瘤模型，研究肿瘤发生机理及评价抗肿瘤药物疗效提供了可行性。Naidoo等［21］将NaHCO3加入到聚己内酯(PCL)油相中制备单乳O/W乳液，通过有机溶剂的挥发制备出微孔球形支架。粒径大小在50～200μm。球内孔径达到75 μm，表面孔径为20 μm。Shi等［22］用 NaHCO3作致孔剂，采用复乳有机溶剂挥发法制备PDLLA多孔微球，通过改变初乳、复乳的搅拌速度以及聚合物在油相中的浓度及水解处理，制造出不同表面孔径的多孔细胞微球，将人骨肉瘤细胞(MG-63)接种到微球表面，实验结果显示MG-63细胞在表面孔径小于10μm的未经过水解的微球上生长良好。说明不同种类的细胞适应不同表面性质的微球。

1.2 喷雾干燥法

喷雾干燥法主要是采用喷雾干燥器来实现，这种方法的优点是操作简便、条件温和、可用于多孔微球的大规模制备。Straub等［23］采用双腔的喷雾干燥器通过喷雾干燥一个包含PLGA、1，2-花生酰基卵磷脂和NH3HCO3的W/O乳液制备出多孔微球AI-700超声造影剂。

1.3 相分离法

相分离法是在药物与材料的混合溶液中加入另一种物质或不良溶剂，或采用其他适当手段使材料的溶解度降低，自溶液中产生一个新相(凝聚相)，这种制备微球的方法称为相分离法。Nihant等［24］研究了相分离过程中搅拌速度、凝聚剂的滴加速度、两相比例等因素对微球表面形态、孔的结构等方面的影响。

1.4 熔融方法

熔融法不使用有机溶剂，对细胞无毒性作用，故所制备的支架可用于组织工程。Yodthong［25］用熔融方法制造出MPEG-b-PCLDLL多孔微球，此方法不添加表面活性剂和有机溶剂，只是通过将MPEG-b-PCLDLL双嵌段聚合物水溶液加热到80℃，磁力搅拌，研究结果显示PDLL的添加比例与微球大小成反比。

2 影响多孔微球用于细胞培养的因素

多孔微球的尺寸、密度和孔大小等因素会影响细胞的培养和物质的输送。此外，微球的化学组成和表面性质，如拓扑形貌、亲疏水性、表面电荷、表面官能团等许多因素也都会对细胞的生长产生重要的影响。

2.1 多孔微球尺寸、密度、孔径大小的影响

2.1.1 尺寸 多孔微球的尺寸影响着细胞的生长行为，细胞贴附数目取决于微球的尺寸(直径在100～400μm之间更有利)。多孔微球的尺寸分布应尽量窄，从而尽可能提供均匀的培养环境。有研究［26］表明，尺寸介于100～250μm的HA/TCP颗粒最有利于骨髓基质细胞的生长以及新骨的形成。

2.1.2 密度 多孔微球的密度应略大于培养基(一般在1.02～1.10之间)，经轻度搅拌便能悬浮在培养基中，停止搅拌便能较快地沉降下来。有研究［27］表明对于采用细胞旋转培养系统进行细胞培养的多孔微球，微球的密度对于细胞培养十分重要。这是因为当微球密度高于培养基密度时，微球会向容器壁部迁移甚至产生碰撞。并且微球与培养基的密度相差越大，微球表面受到的剪切应力越大。剪切应力会影响细胞的生长、新陈代谢和聚集，因此剪切应力的增大以及多孔微球之间和器壁之间的碰撞会破坏细胞的黏附和增殖。

2.1.3 孔径大小 微球的孔径大小也是影响细胞生长的一个重要因素。对于目前的多孔微球，孔径大小只是一个统计学的数据。最基本的想法是，孔的尺寸应该比细胞直径大，以便细胞能够进入球的内部，实现细胞在球内的生长、扩增。对于大多数贴壁细胞，孔大于20μm(一般为40μm)是较为合适的。Messing和Oppermann通过实验证明:对于微生物细胞，合适的微球孔直径应约为细胞直径的1～5倍［28］。然而，对于动物细胞，这样的数据是不具有可比性的，细胞类型、细胞多层生长能力和细胞侵入孔内的能力都会对微球孔径的选择产生影响［29］。

2.2 多孔微球的化学组成和表面性质的影响

2.2.1 亲疏水性 多孔微球亲疏水性对蛋白质的构象有重要影响，进而会影响微球的细胞相容性。不同的细胞对材料的亲疏水性要求不同，大部分研究表明适度亲水性的表面最有利于细胞的黏附和铺展［30］。这是因为微球的亲水性强不利于蛋白质的吸附，从而不利于细胞的黏附。而对于疏水性强的微球表面，一方面非黏附蛋白在微球表面的吸附会阻碍黏附蛋白的吸附;同时，吸附在表面的黏附蛋白分子链的天然构象也会遭到破坏，使蛋白质分子链中与细胞膜表面受体相结合的活性位点(RGD)无法完全暴露，也不利于细胞的黏附［31］。

2.2.2 表面电荷 在生理pH条件下，哺乳动物的细胞表面带有分布不均匀的负电荷，一般认为带有正电荷的微球表面与带负电荷的细胞之间的静电吸引将有利于细胞的黏附。然而一些研究表明细胞在含有负电荷的表面也能够很好地黏附［32］，这可能与表面的化学结构和培养基中阳离子的媒介作用有关。Baldwin等［33］认为表面电荷和离子化基团影响细胞黏附和生长的本质在于黏附蛋白能被选择性地吸附到带电或离子区域，从而调节细胞与表面之间的黏附。

2.2.3 生物活性因子 一般当多孔微球含有具有生物活性的成分时会有利于细胞的生长［34-36］。这是因为在细胞培养中，胶原等一些具有生物活性分子可以为细胞的黏附生长提供结合位点(氨基酸序列，如RGD肽段)。

将生物活性因子固定在材料表面是提高材料细胞相容性的有效手段之一［37］。常见的活性因子包括各种贴壁因子，如胶原、聚赖氨酸、纤维粘连蛋白、层粘连蛋白(LN)和玻璃粘连蛋白;各种生长因子，如成纤维细胞生长因子、促进骨和软骨组织形成的骨形态发生蛋白和血管内皮细胞生长因子等。

3 多孔微球的表面改性

由上述可知，多孔微球表面的性质如亲疏水性、表面电荷以及生物活性因子等都会对细胞在微球表面的黏附和生长能力产生影响。因此，通过对多孔微球表面进行改性，可以促进微载体的组织和细胞相容性。表面改性通常有化学修饰和生物分子修饰两种方法。

3.1 化学修饰

化学修饰是通过化学反应将活性化学基团引入到材料上，从而改善材料对细胞的亲和性。由前述可知，微球表面的亲疏水性、表面电荷都会对细胞的黏附和生长产生影响。因此，针对不同细胞，在微球表面引入氨基、羧基、羟基、磺酸基等基团有助于提高细胞在微球表面的黏附［38］。

3.2 生物分子修饰

目前，生物分子在微球表面的修饰引起广泛关注。首先，生物分子本身具有生物相容性。其次，针对不同细胞可以选择具有针对性的生物分子修饰在多孔微球表面，增强其特异性。常用生物分子及其修饰方法有以下几种。

3.2.1 氨基酸及其衍生物修饰 将亲水性的氨基酸引入多孔微球表面，不仅可以在改善材料的亲水性同时还能够引入羟基、氨基和羧基等基团。这些活性的侧链可以进一步与多肽、蛋白质反应，将其固定以改善多孔微球的细胞亲和性。Nojehdehiana等［39］将表面修饰了多聚赖氨酸同时内部装载视黄酸(RA)的PLGA微球用于多功能胚胎肿瘤干细胞P19的培养，研究RA对于 P19分化成神经细胞的调节作用。这里，PLGA微球既作为一个药物载体，又起到细胞支架的作用。带有正电荷的聚赖氨酸可以改善PLGA微球的细胞黏附性。

3.2.2 胶原修饰 胶原是细胞外最重要的疏水性纤维蛋白，是构成细胞外基质的骨架。胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起作用。胶原具有和细胞表面的整合素特异性结合的蛋白分子配体，因此，在多孔微球的表面修饰胶原可以有效地促进细胞的黏附和分布。Hong等［34］采用O/W分散溶剂挥发法制备出尺寸在180～280μm的PLA微球，随后在己二胺/正丙醇溶液中胺解，将氨基引入在微球表面，戊二醛处理后将氨基转化为醛基，最后通过醛基和胶原分子氨基上的Schiff碱的形成将胶原共价偶联到微球表面。胶原包覆的PLA微球用于体外软骨细胞培养的结果显示，细胞可以在微球上黏附、增殖。可见，胶原修饰过的PLA微球可以作为潜在的体外细胞培养微载体。

3.2.3 LN修饰 LN作为基膜的主要结构成分对基膜的组装起关键作用，其主要功能就是在细胞表面形成网络结构并将细胞固定在基膜上。与此同时，LN还有许多其他的作用，如在细胞发育过程中刺激细胞粘着、细胞运动。Newman等［40］制备出表面修饰LN同时装载RA的PLGA微球，研究胚胎癌细胞P19在微球表面的附着、生长、分化和RA的释放调节P19细胞分化成神经细胞。

3.2.4 RGD活性多肽序列修饰 RGD序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，能够与细胞表面的整合素特异性结合，有效地促进细胞对生物材料的黏附［41］。RGD序列的空间结构、修饰密度、周围序列对其活性都有一定影响［42］。Chen等［43］制备出RGD修饰的聚乳酸(PLLA)微球，并用于软骨细胞组织工程。RGD在提高微球细胞黏附性的同时还可以加强细胞与微球的相互作用。与空白无修饰PLLA微球经过56 d的细胞生长对比实验发现，RGD修饰过的微球可以有效地促进细胞在微球上的黏附及细胞数量的增长。

4 结 语

多孔微球在三维细胞培养中的应用研究逐渐形成一个完整的体系，同时越来越多的应用价值被发掘和应用。其在制备技术、表面改性方法和抗肿瘤药物筛选及组织工程应用等方面都取得了一定的成就。目前，微载体的发展还面临许多困难和难题，如多孔微球的取样及分离、寻找合适的表面修饰分子以及辅助的培养方式，开发一些新的应用等。同时，目前微球的机械性能对细胞生长分化的研究也被提上日程，引起关注。相信随着相关学科的发展，这些问题会一一解决，微载体在肿瘤药物筛选及肿瘤形成机制方面的应用会取得巨大的成就，成为新兴的研究热点。

［1］王中兴，鹿均先，熊传芝.人脂肪干细胞体外培养及向软骨细胞诱导分化的实验研究［J］.东南大学学报:医学版，2009，28(2):126-130.

［2］MARKLEIN R A，BURDICK J A.Controlling stem cell fate with material design［J］.Adv Mater，2010，22:175-189.

［3］VOYTIK-HARBIN SL.Three-dimensional extracellular matrix substrates for cell culture［J］.Methods Cell Biol，2001，63:561-581.

［4］NILSANGS，NEHRU V，PLIEVA F M，et al.Three-dimensional culture for monoclonalantibody production by hybridoma cells immobilized in macroporous gel particles［J］.Biotechnol Prog，2008，24(5):1122-1131.

［5］徐飞，王大伟，陈双峰.电纺PLLA/PVP纳米纤维膜材料用于血管组织工程的前期研究［J］.东南大学学报:医学版，2011，30(3):391-401.

［6］KAUSHAL S，AMIEL GE，GULESERIAN K J，et al.Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo［J］.Nat Med，2001，7(9):1035-1040.

［7］MCNAUGHT A D，WILKINSON A.IUPAC Compendium of Chemical Terminology［C］.2nd Edition.Oxford:Blackwell Scientific Publications，1997:927.

［8］Van WEZEL A L.Growth of cell-strains and primary cells on micro-carriers in homogeneous culture［J］.Nature，1967，216(5110):64-65.

［9］THISSEN H，CHANG K Y，TEBB T A，et al.Synthetic biodegradable microparticles for articular cartilage tissue engineering［J］.J Biomed Mater Res Part A，2006，77A(3):590-598.

［10］MALDA J，FRONDOZA CG.Microcarriers in the engineering of cartilage and bone［J］.Trends Biotechnol，2006，24(7):299-304.

［11］HONG Y，GAO C Y，XIE Y，et al.Collagen-coated polylactide microspheres as chondrocyte microcarriers［J］.Biomaterials，2005，26(32):6305-6313.

［12］KATO D，TAKEUCHI M，SAKURAI T，et al.The design of polymer microcarrier surfaces for enhanced cell growth［J］.Biomaterials，2003，24(23):4253-4264.

［13］MALDA J，KREIJVELD E，TEMENOFF J S，et al.Expansion of human nasal chondrocytes on macroporous microcarriers enhances redifferentiation［J］.Biomaterials，2003，24(28):5153-5161.

［14］KIM H W，GU H J，LEE H H.Microspheres of collagen-apatite nanocomposites with osteogenic potential for tissue engineering［J］.Tissue Eng，2007，13(5):965-973.

［15］MELERO-MARTIN J M，DOWLING M A，SMITH M，et al.Expansion of chondroprogenitor cells on macroporous microcarriers as an alternative to conventional monolayer systems［J］.Biomaterials，2006，27(15):2970-2979.

［16］MALDA J，FRONDOZA CG.Microcarriers in the engineering of cartilage and bone［J］.Trends Biotechnol，2006，24(7):299-304.

［17］刘国诠.生物工程下游技术［M］.北京:化学工业出版社，2003.

［18］GOKMEN M T，DU PREZ F E.Porous polymer particles-A comprehensive guide to synthesis，characterization，functionalization and application［J］.Prog Polym Sci，2012，37(3):365-405.

［19］KIM T K，YOON JJ，LEE DS，et al.Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres［J］.Biomaterials，2006，27:152-159.

［20］SAHOO S K，PANDA A K，LABHASETWAR V.Characterization of porous PLGA/PLA microparticles as a scaffold for three dimensional growth of breast cancer cells［J］.Biomacromolecules，2005，6:1132-1139.

［21］NAIDOO K，ROLFES H，EASTON K，et al.An emulsion preparation for novel micro-porous polymeric hemi-shells［J］.Mater Lett，2008，62:252-254.

［22］SHIX D，SUN L，JIANGJ，et al.Biodegradable polymeric microcarriers with controllable porous structure for tissue engineering［J］.Macromol Biosci，2009，9:1211-1218.

［23］STRAUB JA，CHICKERING D E，CHURCH CC，et al.Porous PLGA micropaticles:AI-700，an intravenously administered ultrasound contrast agent for use in echocardiography［J］.JControl Release，2005，108(1):21-32.

［24］NIHANT N，GRANDFILSC.Microencapsulation by coacervation of poly(lactide-co-glycolide)IV.Effect of the processing parameters on coacervation and encapsulation［J］.J Control Release，1995，35(2):117-125.

［25］YODTHONG B.Porous microspheres of methoxy poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactoneco-D，L-lactide)prepared by a melt dispersion method ［J］.Polymer，2009，50:4761-4767.

［26］MANKANI M H，KUZNETSOV SA，FOWLER B，et al.In vivo bone formation by human bone marrow stromal cells:Effect of carrier particle size and shape［J］.Biotechnol Bioeng，2001，72(1):96-107.

［27］QIU Q Q，DUCHEYNE P，AYYASWAMY P S.Fabrication，characterization and evaluation of bioceramic hollow microspheres used as microcarriers for 3-Dbone tissue formation in rotating bioreactors［J］.Biomaterials，1999，20(11):989-1001.

［28］SUTHERLAND R M.Cell and environment interactions in tumor microregions:the multicell spheroid model［J］.Science，1988，240:177-184.

［29］王佃亮，肖成祖.动物细胞高密度培养用多孔微球［J］.生物工程进展，1998，18(2):46-49.

［30］WEBB K，HLADY V，TRESCO P A.Relative importance of surface wettability and charged functional groups on NIH 3T3 fibroblast attachment，spreading，and cytoskeletal organization［J］.Biomed Mater Res，1998，41(3):422-430.

［31］TZIAMPAZISE，KOHN J，MOGHE PV.PEG-variant biomaterials as selectively adhesive protein templates:model surfaces for controlled cell adhesion and migration［J］.Biomaterials，2000，21(5):511-520.

［32］LEE JH，KHANG G，LEE J W，et al.Platelet adhesion onto chargeable functional group gradient surfaces［J］.Biomed Mater Res，1998，40(2):180-186.

［33］BALDWIN SP，SALTZMAN W M.Polymers for tissue engineering［J］.Trends Polym Sci，1996，4(6):177-182.

［34］HONG Y，GAO C Y，XIE Y，et al.Collagen-coated polylactide microspheres as chondrocyte microcarriers［J］.Biomaterials，2005，26(32):6305-6313.

［35］KIM H W，GU H J，LEE H H.Microspheres of collagen-apatite nanocomposites with osteogenic potential for tissue engineering［J］.Tissue Eng，2007，13(5):965-973.

［36］GARKHAL K，VERMA S，TIKOO K，et al.Surface modified poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone)microspheres as scaffold for tissue engineering［J］.J Biomed Mater Res Part A，2007，82A(3):747-756.

［37］HERSEL U，DAHMEN C，KESSLER H.RGD modified polymers:biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond［J］.Biomaterials，2003，24(24):4385-4415.

［38］SINGHVI R，KUMAR A，LOPEZ G P，et al.Enginerring cell shape and function［J］.Science，1994，264:696-698.

［39］NOJEHDEHIANA H，MOZTARZADEH F，BAHARVAND H.Preparation and surface characterization of poly-l-lysine-coated PLGA microsphere scaffolds containing retinoic acid for nerve tissue engineering:in vitro study［J］.Colloid Surf BBiointerfaces，2009，73:23-29.

［40］NEWMAN K D，MCBURNEY M W.Poly(d，l lactic-co-glycolic acid)microspheres as biodegradable microcarriers for pluripotent stem cells［J］.Biomaterials，2004，5:5763-5771.

［41］HYNES R O.Integrins:bidirectional，allosteric signaling machines［J］.Cell，2002，110(6):673-687.

［42］HERSEL U，DAHMEN C，KESSLER H.RGD modied polymers:biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond［J］.Biomaterials，2003，24:4385-4415.

［43］CHEN R，CURRAN SJ，CURRAN J M.The use of poly(L-lactide)and RGD modied microspheres as cellcarriers in a ow intermittency bioreactor for tissue engineering cartilage［J］.Biomaterials，2006，27:4453-4460.