实验性肝损伤模型的研究进展

张东梅，黄欣，闫春雷，苏乐群 （．山东大学药学院，山东 济南500；．山东省千佛山医院，山东 济南5004）

肝脏疾病是影响人类健康的最为常见的疾病之一，目前对于肝脏疾病的防治仍是一个严峻的课题，因此肝损伤动物模型的复制对于肝脏发病机制研究及护肝药物的筛选具有重要的现实意义。目前，肝损伤动物模型的复制主要有化学性、免疫性、酒精性、药物性、生物性等方法，其中生物学方法要求实验条件高且费用昂贵，多用于病原体及其致病机制的高层次研究；目前科研中较常用的是化学性肝损伤、免疫性肝损伤和酒精性肝损伤模型［1］。本文简要综述了建立急、慢性肝损伤动物模型的机制、方法、特点、应用及优缺点，以期为肝损伤动物模型的选择提供参考。

1 化学性肝损伤

1．1 四氯化碳（CCl4） CCl4是经典的复制肝损伤动物模型的化学物质，其肝损伤的机制与CCl4经细胞色素P450代谢产生的三氯甲烷自由基引发的链式过氧化反应有关。三氯甲烷自由基生成后引起膜系统发生脂质过氧化反应，与肝细胞蛋白或DNA结合破坏肝细胞机能，导致肝细胞损伤坏死。

成年大鼠（Wistar／SD，6～8周龄，雄性多用，下同），一次性腹腔或皮下注射CCl41 mL·kg－1（40%～50%CCl4植物油溶液），24 h左右可形成急性肝损伤模型；采用40%的CCl4植物油溶液按照CCl41 mL·kg－1灌胃或腹腔注射，每周2次，持续8～12周可形成慢性肝损伤大鼠模型。苯巴比妥、丙酮和酒精等细胞色素P450同工酶化学诱导剂可加强CCl4的肝毒性，缩短CCl4慢性肝损伤的造模时间。

CCl4诱导的肝损伤模型不仅在病理生理方面与人类肝脏疾病的改变相类似，而且重复性好且经济。但该模型属于中毒性肝损伤范畴，在免疫病理上与多数肝炎有很大区别，不适于对有护肝作用的免疫调节剂或影响免疫系统的护肝药物评价。另外，CCl4除损害肝组织外，对其他脏器也有损伤，死亡率高。因CCl4挥发性较大，对实验人员也有一定的伤害，操作时应注意防护。

1．2D－氨基半乳糖D－氨基半乳糖（D－galactosamine，DGalN）属于间接肝毒剂，肝损伤机制与其在肝内的代谢及随后对核苷酸合成的影响有关，其作用机制是：氨基半乳糖与肝细胞内尿苷二磷酸（UDP）结合而形成复合物，使尿苷三磷酸（UTP）耗竭，肝细胞中的RNA和蛋白合成受阻，质膜结构蛋白合成减少，使UDPG尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶－焦磷酸化酶活性和数量均下降，引起糖和磷脂代谢障碍，膜损伤加重，引起肝细胞坏死。肝细胞坏死，细胞外钙大量内流，引起细胞内钙稳态破坏，进一步引起代谢紊乱，导致细胞的死亡。另外，氧化应激及炎症反应在肝损伤的过程中也发挥了重要作用［2］。

成年大鼠按600～900 mg·kg－1剂量一次性腹腔注射给药，24～48 h后即可制成急性肝损伤模型［3］。剂量超过1 000 mg·kg－1时，常引起广泛性肝坏死。

D－GalN所致肝炎的病理生理改变与人类急性病毒性肝炎非常相似，该模型是目前评价病毒性肝炎治疗药物疗效的较好模型，但该模型与CCl4肝损伤同属于中毒性肝损伤范畴，也不适于对有护肝作用的免疫调节剂或影响免疫系统的护肝药物评价。氨基半乳糖仅对肝脏有影响，不影响其他器官，但是氨基半乳糖较贵，限制了其广泛应用。

1．3 α－萘基异硫氰酸酯（α－naphthyl isothiocyanate，ANIT）

ANIT是一种间接肝毒剂，常用于诱导急性肝内胆汁淤积模型。目前认为ANIT引起的肝损伤与谷胱甘肽－ANIT结合物的形成和胆汁排泄有关。ANIT与谷胱甘肽可逆性结合，然后通过小管外排途径运输到胆汁，使胆汁内ANIT聚积，损害肝内胆管上皮细胞，引起肝内胆管增生及小叶间胆管周围炎症，从而造成胆管阻塞，导致胆汁酸和其他胆汁成分在肝脏中积累，并最终产生肝胆毒性。长期腹腔注射ANIT导致的肝损伤与线粒体功能障碍有关。

将ANIT溶解于橄榄油溶液，成年大鼠按60～100 mg·kg－1剂量灌胃给药，24～48 h即可形成ANIT急性肝损伤动物模型［4］。采用80 mg·kg－1的剂量腹腔注射，每周1次，持续16周，可形成慢性肝损伤模型。

ANIT急性肝损伤模型病理学检查可见以点状坏死为主的肝实质细胞损害，产生胆汁郁积性黄疸，出现高胆红素血症和胆汁分泌减少，用于模拟人类药物性胆汁淤积和肝损伤。该模型复制简单易行，重现性好，是筛选保肝利胆药的理想实验动物模型。

1．4 二甲基亚硝胺（dimetylnitrosamine，DMN） DMN 是致癌物和诱变剂，具有较强的肝毒性。其肝损伤的机制是：DMN经肝脏CYP2E1代谢活化产生的甲醛和甲醇与核酸和蛋白质发生烷基化反应，造成细胞内大分子损伤，肝细胞凋亡坏死。肝脏受致病因子侵袭后，基质金属蛋白酶－2（MMP－2）的表达与活性增高，肝星状细胞活化，导致细胞增殖及胶原蛋白沉积，促进肝纤维化的形成与发展。同时激活的MMP－2促进窦内皮细胞形成肝窦毛细血管化，加重肝损伤［5］。

用0．15 mol·L－1NaCl将 DMN稀释为1%浓度，采用成年大鼠或Balb／c小鼠，按10 mg·kg－1剂量大鼠腹腔注射，每周3次，持续3～4周可形成肝纤维化动物模型。

DMN诱导的大鼠慢性肝损伤在初期出现胶原蛋白沉积，这是肝纤维化和肝硬化发病的关键。该模型是研究肝纤维化机制、筛选治疗肝纤维化药物的良好动物模型。DMN诱导的大鼠肝纤维化形成率高，且形成后相对稳定，但DMN毒性较大，易挥发，并且排泄物含有毒物，污染环境。

1．5 硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA） TAA 摄入后，经肝脏混合功能氧化酶系统代谢活化为TAA硫氧化物，继而代谢产生自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS），它们与细胞内大分子结合，导致细胞脂质过氧化，还原型谷胱甘肽减少，诱导氧化应激。另外细胞内钙稳态被破坏，细胞内钙持续升高。ROS形成增加和钙稳态的破坏使线粒体内膜渗透性增加，膜电位改变，这些变化激活多个相关的导致细胞损伤或增殖的机制，从而促进肝纤维化肝硬化的发展。

成年大鼠采用400 mg·kg－1的剂量腹腔注射TAA，12～24 h后即造成大鼠急性肝衰竭模型；采用200 mg·kg－1剂量腹腔注射，每周3次，持续8周可形成典型的肝纤维化模型［6］；采用含 TAA300 mg·L－1（约为25 mg·kg－1·d－1）的饮水喂养3～4个月可诱导大鼠形成肝硬化模型。

TAA诱发的肝纤维化与人肝纤维化的生化病理变化相似，并且死亡率低、成功率高，形成的肝纤维化相对稳定不易逆转，是经典的肝纤维化模型之一，适用于肝纤维化机制的研究与治疗药物的筛选评价等。

2 免疫性肝损伤

2．1 刀豆蛋白A（Con A） Con A诱导的肝损伤模型是由T细胞介导的，依赖于CD4＋T细胞和巨噬细胞之间相互作用，通过淋巴细胞、单核细胞以及肝脏中的Kupffer细胞参与的炎症反应造成肝损伤。在此过程中细胞因子TNF－α、IFN－γ、IL－6等在细胞增殖及凋亡和坏死中起重要作用［7］。

6～8周龄雄性Balb／c小鼠一次性尾静脉注射ConA15～20 mg·kg－1，12 h可形成急性免疫性肝损伤模型［8］；尾静脉注射ConA10 mg·kg－1，每周1次，持续8周，可形成慢性免疫性肝损伤模型［9］。

ConA诱导的肝损伤模型是由T淋巴细胞介导的，较好地模拟人类病毒性肝炎引发的免疫性肝损伤的病理生理过程。ConA所致的肝损伤具有剂量依赖性和器官特异性，制作简单无需预先致敏。该模型与人类病毒性肝炎相比，不存在病毒复制和肝实质持续损伤的过程，仅有利于从免疫学角度探讨发病机制和评价药物疗效。

2．2 BCG联合细菌脂多糖（LPS） LPS是一种内毒素，可诱发预先接种卡介苗（BCG）的小鼠形成急性肝损伤模型。BCG联合LPS诱导的肝损伤，其损伤机制是以细胞免疫为主的变态反应，BCG首先激活致敏T淋巴细胞，尤其是致敏肝内Kupffer细胞和巨噬细胞，当注射LPS后进一步激活致敏的Kuppfer细胞和巨噬细胞，使其释放大量的细胞毒因子，如肿瘤坏死因子、一氧化氮、白细胞介素、自由基、白三烯等造成肝细胞损害。

采用6～8周龄雄性昆明小鼠或C57BL／6小鼠，首先尾静脉注射含5×106－7个活菌的BCG生理盐水溶液，致敏T淋巴细胞。10 d后，尾静脉注射含7．5～10μg LPS的脂多糖生理盐水，16 h后形成免疫性肝炎模型［10］。

BCG联合LPS诱导的肝损伤模型的病理过程，与人类肝炎中Kupffer细胞等非特异性免疫细胞在肝细胞内浸润并释放大量细胞因子造成的肝细胞损害的病理过程相似。该模型为临床研究病毒性肝炎发病机制以及从免疫途径筛选护肝药物提供了良好的动物模型，并且造模时间短，方法简便易行。但该模型制作过程中需用BCG预先致敏，BCG批号不同，活性可能存在差别，所以实验前需对BCG用量进行摸索调整。另外也可用灭活的短小棒状杆菌或痤疮丙酸杆菌预先致敏。

2．3D－GalN联合LPSD－GalN可耗竭肝细胞内 UTP，抑制RNA合成；促使肥大细胞脱颗粒，释放组胺，引发结肠水肿，增强机体对LPS的敏感性。LPS活化Kupffer细胞和巨噬细胞合成和分泌TNF－α及其他炎性细胞因子，使D－GalN致敏小鼠发生的肝细胞凋亡和坏死；此外氧自由基产生的氧化应激也是一种重要的损伤因素。最近研究表明，在DGalN联合LPS介导的急性肝衰竭与JNK的持续性活化有关［11］，因为JNK的持续的活化会导致细胞凋亡的发生。

6～8周龄雄性Balb／c小鼠，按D－GalN300～700 mg·kg－1和LPS50～10μg·kg－1的剂量腹腔注射，16 h后可形成小鼠免疫性急性肝损伤模型。

D－GalN联合LPS诱导的肝损伤模型被认为是内毒素引起肝损伤的良好模型，在内毒素性肝损伤的损伤机制研究及相关药物的筛选评价中具有重要意义，但在制作过程中需要预先致敏。

3 药物性肝损伤

3．1 对乙酰氨基酚（AP） AP的肝毒性与其在肝内的代谢有关。通常情况下，AP主要在肝内与硫酸盐和葡糖苷酸结合，只有少量被CYP2E1酶降解为高毒性的活性代谢物N－乙酰－对－苯醌亚胺（NAPQI），NAPQI与线粒体内还原型谷胱甘肽（GSH）结合后解毒。当AP剂量过大时（超过12～15 g），其代谢过程中产生的大量NAPQI超过了GSH的解毒能力，未被清除的NAPQI与细胞和线粒体蛋白质结合，影响它们的功能并最终导致细胞坏死。

将AP加热溶于生理盐水，按300～500 mg·kg－1剂量给6～8周龄雄性Balb／c小鼠一次性腹腔注射，也可用2．5%的AP混悬液灌胃给药，24 h后可形成急性肝损伤模型。

AP诱导的急性肝损伤模型出血和脂肪变性不明显，形态学主要表现为以中央静脉为中心的圆盘状大量细胞坏死，多用于因各种原因导致谷胱甘肽含量减少而引起肝细胞损伤的治疗药物筛选。AP诱导的肝损伤对小鼠十分敏感而对大鼠不敏感。

3．2 异烟肼联合利福平 异烟肼和利福平两药联用是目前结核病短程疗法的治疗方式，但两药联用肝毒性明显增加，其机制是：异烟肼在肝脏中经过CYP450代谢为乙酰肼及肼，肼与巯基反应导致肝内的GSH耗竭而引起细胞膜及线粒体膜的脂质过氧化，线粒体膜通透性改变，肝细胞损伤。而利福平在肝脏中去乙酰化，为异烟肼乙酰化提供乙酰基，且利福平诱导CYP450酶，使异烟肼代谢加快，乙酰肼代谢的活性中间体及肼的量相继增加，导致肝毒性明显增加。

成年大鼠灌胃或腹腔注射异烟肼50～100 mg·（kg·d）－1，利福平50～100 mg·（kg·d）－1，持续3～4周，可形成大鼠肝损伤模型［12］。

异烟肼联合利福平建立的大鼠肝损伤模型，病理学检查可见肝细胞肿胀、淤血，羽毛状变性，小叶中心区域出现炎症［13］。该模型为深入研究人类异烟肼利福平联用导致肝损伤的发病机制提供较好的动物模型。

4 酒精性肝病

目前酒精对肝损伤的机制尚未完全阐明，认为其发病机制与氧化应激、线粒体功能损伤、内质网应激和免疫／炎症反应等多种因素有关［14］。首先，乙醇在肝脏中的毒性代谢产物乙醛能诱导肝脏氧化应激，使线粒体和微管系统受损。乙醇经过微粒体乙醇氧化系统中CYP 2E1代谢产生ROS，导致氧化损伤；其次，长期乙醇暴露会损伤线粒体功能，导致生物能量减少，ROS产生增加，GSH减少，线粒体DNA损伤和蛋白质合成抑制，线粒体通透性敏感性增加，通过坏死和细胞凋亡途径引起肝损伤；另外长期大量饮酒可激活肝脏的Kupffer细胞产生大量核转录因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB），NF－κB促进活化的肝脏Kupffer细胞产生产生大量的炎症因子 TNF－α、IL－1等［15］，从而引起肝细胞脂肪变性、炎症、坏死，同时刺激肝细胞增生，抑制胶原酶活性，促进肝纤维的形成。

成年大鼠或小鼠以50～60度白酒一次性灌胃或腹腔注射4～6 g·kg－1，4～24 h可形成急性酒精性肝损伤模型［16］。大鼠按照15 mL·kg－1的剂量灌胃50～60度的白酒，每天1次，12周可形成慢性酒精性肝损伤模型。另有一些学者采用梯度浓度酒精，分次少量灌胃的方法，对制作大鼠慢性酒精性肝损伤模型的方法进行了改进。

慢性酒精性肝损伤模型病理学检查可见肝细胞脂肪变性，坏死严重，炎症细胞浸润。一些坏死区可见明显的纤维细胞增生，相邻肝小叶中央静脉之间或相邻汇管区之间出现桥接坏死。该模型与人类酒精性肝病病变相似，稳定可靠，对于人类酒精性肝病的发病机制的研究以及保肝药物的筛选具有重要意义。缺点是造模时间长，频繁灌胃较为繁琐且操作不当可造成动物窒息死亡。

5 缺血再灌注损伤（IR）

IR是指缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。研究发现微循环障碍、氧自由基过多、钙超载、Kuffer细胞活化及细胞凋亡等是引起肝脏缺血再灌注损伤的重要机制。首先肝细胞因缺血、缺氧使ATP生成减少，钙离子进入细胞增多，使细胞膜以及线粒体功能受损。当再灌注时，氧气增多，生成大量的自由基，而此时线粒体功能受损，对氧自由基的清除能力不足，导致氧自由基增多，损伤膜系统、蛋白质、核酸及细胞外基质，从而进一步加重细胞的凋亡。另外多种细胞因子和促炎性因子也参与了肝脏缺血再灌注损伤的病理生理过程。

肝脏缺血再灌注损伤是影响移植肝存活率的一个重要因素。该模型可用于再灌注损伤的发病机制研究，缺血后处理以及药物后处理的研究探索，对于减轻及预防缺血再灌注损伤和改善预后，具有十分重要的意义。

综上所述，目前肝损伤模型的造模方法很多，根据研究目的，选择特定有针对性的肝损伤动物模型非常必要，但由于影响肝功能的因素多，且造成肝损伤的机制复杂，无论哪种实验性模型都存在缺陷，都不能全面、准确地反映人类特定肝损伤的本质。相信随着对肝脏疾病研究的深入，相应的肝损伤动物模型将不断地完善；同时，肝损伤动物模型的完善也将推动着肝脏疾病研究的向前发展。

［1］徐叔云，卞如濂，陈修．药理实验方法学［M］．3版．北京：人民卫生出版社，2002：1346－1352．

［2］Pushpavalli G，Kalaiarasi P，Veeramani C，etal．Effect of chrysin on hepatoprotective and antioxidant status in D－galactosamine－induced hepatitis in rats［J］．Eur J Pharmacol，2010，631（1－3）：36－41．

［3］姚莉，骆勤，李红卫，等．柳茶对D－半乳糖胺肝损伤的保护作用及机制［J］．中国医院药学杂志，2010，30（06）：483－484．

［4］Ding LL，Zhang BF，Dou W，etal．Protective effect of Danning tablet on acute livery injury with cholestasis induced by alpha－naphthylisothiocyanate in rats［J］．J Ethnopharmacol，2012，140（2）：222－229．

［5］Sakaida I，Hironaka K，Terai S，etal．Gadolinium chloride reverses dimethylnitrosamine （DMN）－induced rat liver fibrosis with increased matrix metalloproteinases（MMPs）of Kupffer cells［J］．Life Sciences，2003，72（8）：943－959．

［6］刘煜，吕若芸，万博，等．硫代乙酰胺诱导肝纤维化模型及其血清学诊断数学模型的构建［J］．药物生物技术，2009，16（6）：554－558．

［7］Shin JW，Wang JH，Kim HG，etal．CGX，a traditional Korean medicine ameliorates concanavalin A－induced acute liver injury［J］．Food Chem Toxicol，2010，48（12）：3308－3315．

［8］Yin XD，Jia PJ，Pang Y，etal．Protective effect of FTY720 on several markers of liver injury induced by concanavalin A in mice［J］．Current Therapeutic Research，2012，73：140－149．

［9］Tu CT，Li J，Wang FP，etal．Glycyrrhizin regulates CD4＋T cell response during liver fibrogenesis via JNK，ERK and PI3K／AKT pathway［J］．Int Immunopharmacol，2012，14（4）：410－421．

［10］Liu T，Zhao J，Ma L，etal．Hepatoprotective effects of total triterpenoids and total flavonoids from vitis vinifera L against immunological liver injury in mice［J］．Evid Based Complement Alternat Med，2012，1－8．

［11］黄坤，胡瑾华，许执恒，等．c－Jun氨基末端激酶在D－半乳糖胺／脂多糖诱导急性肝衰竭小鼠肝组织中的表达及意义［J］．中华临床医师杂志（电子版），2011，5（9）：2518－2522．

［12］钱妍，魏来，赵春景．番茄红素对异烟肼和利福平致大鼠肝损伤的保护作用［J］．中国药理学通报，2007，23（9）：1246－1249．

［13］张瑶纾，吴志丽，王焕，等．桔梗对异烟肼和利福平致小鼠肝损伤的保护作用［J］．天津医科大学学报，2010．16（4）：577－579．

［14］Cohen JI，Nagy LE．Pathogenesis of alcoholic liver disease：interactions between parenchymal and non－parenchymal cells［J］．J Dig Dis，2011，12（1）：3－9．

［15］Khan AQ，Nafees SSultana S．Perillyl alcohol protects against ethanol induced acute liver injury in Wistar rats by inhibiting oxidative stress，NFκ－B activation and proinflammatory cytokine production［J］．Toxicology，2011，279（1－3）：108－114．

［16］Chen P，Wang Z，Zeng L，etal．A novel soluble beta－glucan salecan protects against acute alcohol－Induced hepatotoxicity in mice［J］．Biosci Biotechnol Biochem，2011，75（10）：1990－1993．