罗田金银花叶中绿原酸的提取工艺改进

向 福 刘 亮 秦 婷 曹 禺 方元平 项 俊

（1．经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室，湖北 黄州 438000；

2．黄冈师范学院，湖北 黄州 438000）

金银花为忍冬科植物的花蕾及初开的花，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤，及解热抗炎、利胆保肝、降脂、止血、抗溃疡等药理作用［1］，可广泛用于医药、食品和保健等领域。绿原酸是金银花的主要活性成分，高纯度绿原酸价格昂贵，被称为“植物黄金”［2］。湖北罗田县特产罗田金银花为盘叶忍冬（Lonicera tragophylla Hemsl），香气浓郁，绿原酸等有效成分高，2011年获中国地理标志产品保护。

长期以来，金银花叶一直被视为非药用部位而未能得到合理开发和利用，造成了资源极大的浪费。事实上，十多年前人们就发现山东、河南等地金银花叶中的绿原酸含量几乎超过了同一时期的金银花［2，3］。后来还发现金银花叶和金银花在临床上均有清热解毒之功效，金银花的茎叶，尤其是叶的有效成分的药理作用不亚于金银花［4］。笔者［5］前期发现罗田金银花叶中的绿原酸含量高达7%左右，超过同一时期花中含量的一倍多。另一方面，金银花叶药源远比金银花丰富。有研究［6］表明，金银花叶的产量大约是同期花产量的10倍，且采集容易，价格便宜。当前金银花价格逐年看涨，采用金银花叶提取绿原酸，不仅能降低生产原料成本，还能科学合理利用金银花资源。因此，研究罗田金银花叶中绿原酸的提取工艺，可为地方金银花资源高附加值产品的精深加工提供科学依据和技术支撑，对促进大别山地区金银花产业的发展具有重要的应用价值和现实意义。

绿原酸提取的传统工艺为醇提法和水提法：醇提法虽然绿原酸的产率高、提取杂质少，但有机溶剂消耗量大；水提法虽无需消耗有机溶剂，但多糖等水溶性杂质多、绿原酸的产率低［7］。Zhao等［8］研究表明，多孔介质孔内液体沸腾时会产生对流。植物内为多孔结构，孔内溶液沸腾所产生的对流则带动孔内的质量传递。韦藤幼等［9］研究发现，乙醇溶液浸入植物内部溶解的有效成分浓度较高，孔内沸腾时随对流从植物内部快速扩散到植物外部，提取速度发生突变，提取过程得到强化。考虑到绿原酸一方面对热敏感，稳定性较差，不宜进行长时间高温提取；另一方面又易溶于乙醇，且不同浓度的乙醇溶液透过细胞壁和解吸绿原酸的能力不同，本试验在传统工艺基础上提出一种改进工艺，即先用少量乙醇溶液浸析金银花叶，将绿原酸从细胞组织中溶解，然后加入沸水使金银花叶孔内的乙醇溶液迅速沸腾而强化提取效果，从而大大缩短提取时间和减少乙醇溶液消耗，节约生产成本。

1 材料与方法

1．1 材料、试剂与仪器

罗田金银花叶：湖北楚天舒药业有限公司，阴干，粉碎备用（80目）；

绿原酸标准品：批号20120117，上海源叶生物科技有限公司；

无水乙醇、浓盐酸、氢氧化钠：分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；

紫外 可 见 分 光 光 度 计：Varian Cary 100Scan 型，美 国Varian公司；

电子 天 平：Ax－205 METTLER TOLEDO 型，瑞 士 梅 特勒－托利多集团；

旋转蒸发器：RE－S2AA 型，上海亚荣生化仪器厂。

1．2 试验方法

1．2．1 水提法 将金银花叶粉碎，称取10．00g粉末并加入蒸馏水，固液比为1∶20（m∶V），80 ℃回流45 min，共提3次，冷却至室温过滤，合并滤液，用旋转蒸发器在70 ℃条件下浓缩至50mL左右，得绿原酸提取液。

1．2．2 醇提法 将金银花叶粉碎，称取10．00g粉末并加入120mL 70%乙醇溶液，于80 ℃下回流60min，冷却至室温，过滤，重复3次，滤液合并，用旋转蒸发器在70 ℃条件下浓缩至50mL左右，得绿原酸提取液。

1．2．3 改进工艺 将金银花叶粉碎，称取10．00g粉末并加入一定体积及浓度的乙醇溶液，常温下浸析过夜，再加入一定体积和pH 的沸腾蒸馏水，在沸水水浴中搅拌提取一定时间，提取3次，冷却至室温过滤，合并滤液，用旋转蒸发器在70 ℃条件下浓缩至50mL左右，得绿原酸提取液。

为探讨改进工艺的最佳操作条件，针对关键因子设计了单因素试验，各因素水平梯度：乙醇体积分数为55%，60%，65%，75%，80%；乙醇浸析料液比1∶3，1∶3．5，1∶4，1∶4．5，1∶5（m ∶V）；沸水料液比1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25（m∶V）；pH 值2，3，4，5，6；水浴搅拌时间10，20，30min。

1．3 绿原酸含量测定

1．3．1 最大波峰扫描 精密称定绿原酸标准品5 mg，用蒸馏水混匀定容到10mL 即为标准品溶液。用紫外可见分光光度计扫描绿原酸标准品溶液，确定检测波长为323nm。

1．3．2 标准曲线测定 精密吸取绿原酸标准品溶液5，10，15，20，25，30，35，40，45，50μg／mL，测定吸光度，回归处理结果表明，绿原酸在5 ～50μg／mL 浓度范围与吸光度呈良好线性关 系，回 归 方 程 为Y ＝0．043 5 X ＋0．021 7，R2＝0．999 4。

1．3．3 绿原酸含量测定 用紫外可见分光光度计于323nm 处测定绿原酸提取液的吸光度，根据标准液拟合的回归方程计算绿原酸含量。

2 结果与讨论

2．1 乙醇浓度的影响

图1是罗田金银花叶粉末在35 mL 乙醇溶液浸析过夜后，用200mL pH 为4的沸水水浴搅拌提取10min条件下，不同乙醇浓度提取绿原酸的结果。

图1 乙醇浓度对绿原酸提取浓度的影响Figure1 Effects of alcohol concentration on extraction

由图1可知，在乙醇浓度60%时出现一个峰值，绿原酸提取浓度达到最佳。随着乙醇浓度的增加，绿原酸的提取浓度持续下降，在80%乙醇浓度时略有回升。乙醇溶液浸析金银花叶的过程相当于绿原酸在细胞中的解析过程，不同浓度的乙醇溶液解析细胞内活性物质的能力不同。图1结果表明60%乙醇溶液解析效果最好，提取的绿原酸浓度高。

2．2 乙醇用量的影响

金银花叶粉末在60%乙醇浸析过夜后，用200 mL pH为4的沸水水浴搅拌提取10 min条件下，不同乙醇用量对绿原酸提取效果的影响见图2。

图2 乙醇用量对绿原酸提取浓度的影响Figure2 Effects of alcohol volume on extraction

由图2可知，随着乙醇浸析料液比的增加，提取的绿原酸浓度迅速达到最大值。当乙醇的浸析物料比较低时，乙醇用量少，细胞中的绿原酸不能充分解析，所提取绿原酸的浓度低，吸光度值小。但当乙醇的物料比达到1∶3．5（m∶V）后（即35mL），绿原酸已充分解吸，再增加乙醇的浸析物料比，绿原酸的浓度无明显变化。因此，试验中确定乙醇溶液最适用量为35mL。

2．3 沸水用量的影响

金银花叶在35mL 60%乙醇溶液浸析后，在pH 4条件下用不同物料比的沸水水浴搅拌提取10min，结果见图3。

图3 沸水用量对绿原酸提取浓度的影响Figure3 Effects of boiling water volume on extraction

由图3可知，当沸水用量达到200 mL 时绿原酸的浓度已经增加缓慢，即料液比为1∶20（m∶V）的沸水用量即可获得较好的提取效果。沸水用量少，不足以充分提取绿原酸，但沸水用量太大反而会增加多糖等水溶性杂质的溶出。

2．4 pH 的影响

金银花叶在35mL 60%乙醇溶液浸析后，在不同pH 条件下用200mL沸水水浴搅拌提取10min，结果见图4。

图4 pH 对绿原酸提取浓度的影响Figure4 Effects of pH on extraction

由图4可知，绿原酸的浓度在pH 4达到峰值，随着pH值的增加，绿原酸浓度变化趋于平缓。该结果表明，酸性有利于绿原酸的提取，pH 为4时罗田金银花叶中的绿原酸提取效果较好。

2．5 水浴搅拌时间的影响

金银花叶在35 mL 60%乙醇溶液浸析后，用200 mL pH 为4的沸水水浴搅拌提取不同时间，结果见图5。由图5可知，水浴搅拌时间为10min时的提取效果最好，随着时间的增加，绿原酸的浓度有所下降。金银花叶中绿原酸的提取过程实质是固相传递至液相的传质过程，也就是绿原酸从高浓度区向低浓度区的渗透过程。搅拌提取初期金银花叶与溶剂中的绿原酸在单位时间内具有较高的浓度差，浸出较快，但金银花叶处于长时间高温浸提，会导致表面产生过熟化和结膜以及物料内胶质等过度糊化［10］，阻碍绿原酸浸出。

图5 水浴搅拌时间对绿原酸提取浓度的影响Figure5 Effects of stirring time on extraction

绿原酸为热敏性物质，热稳定性较差，较高温度下进行长时间提取易分解，这是导致高温提取10 min后绿原酸浓度下降的主要原因之一。另外，随着提取时间的延长，提取物中的多糖等杂质会大量增加，必然导致提取物中绿原酸含量的降低。因此，沸水浴中搅拌提取绿原酸的最佳时间为10min。

2．6 改进工艺的优势

根据以上单因素分析，确定改进工艺的最佳操作参数为浸析乙醇浓度60%，浸析物料比1∶3．5（m∶V），沸水物料比1∶20（m∶V），pH 为4，沸水水浴搅拌10min，该条件下提取罗田金银花叶中绿原酸较传统水提法和醇提法在提取时间和乙醇用量两方面都有明显优势（见表1）。改进工艺中由于金银花叶经过乙醇溶液浸析，将绿原酸从细胞组织中溶解，在沸水作用下乙醇溶液在金银花叶微孔内沸腾，强化了绿原酸的提取速度，提取时间比传统水提法减少3．5倍，只有醇提法的1／6。就乙醇用量而言，传统水提过程无乙醇消耗，醇提法乙醇消耗量大，而改进工艺的乙醇消耗量相对较小，约为醇提法的8．3%左右（按无水乙醇计）。

表1 不同提取方法比较Table1 Results from different extraction methods

针对金银花叶中绿原酸的产业化分离，笔者课题组利用D101大孔树脂建立了经济可行的生产工艺［11］。

3 结论

（1）与传统提取法相比，用乙醇溶液浸析、内部沸腾的改进工艺能强化罗田金银花叶中绿原酸的提取过程，具有提取时间短、乙醇用量少等特点，简单易行，有利于工业化生产。最佳工艺参数为乙醇浓度60%，浸析乙醇物料比1∶3．5（m∶V），pH 4，沸水物料比1∶20（m∶V），水浴搅拌10min。

（2）本试验将罗田金银花叶进行利用，增加了金银花资源的精深加工力度，扩展了金银花资源的综合利用范围，可促进大别山地区或其他金银花产地金银花产业的发展。

（3）用响应面分析优化最佳提取工艺以及乙醇溶液在金银花叶中内部沸腾的机理有待进一步研究。

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