全脂乳粉需氧芽孢总数检验中不确定度的评定

杨 滔

（湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410111）

芽孢杆菌（Spore－forming Bacillus）能够在特定环境条件下由其细胞质高度浓缩脱水而形成一种可以抵抗外界不利因素的特殊休眠体——芽孢（spore），根据其对气体的需求类型可以分为需氧型和兼性厌氧型两大类，根据其形态又可分为杆菌和梭菌。对热、紫外线、电磁辐射和某些化学物质有很强抗性的芽孢可耐受各种不良环境，如可以在pH 为2．0～3．0的环境中生存，可以在温度高达80 ℃甚至以上的条件下生长，南极寒冷的冰雪中也能见到他们的踪迹［1］。因此芽孢杆菌对外界有害因子抵抗力较强，广泛分布于土壤、水体、大气以及动物胃肠道等，即使经过杀菌处理后的乳粉，仍有可能残存一定量需氧型芽孢杆菌。在乳中，这些芽孢杆菌都会不同程度的引起乳及乳制品的变质，可以使鲜乳、酸奶中的蛋白质、脂肪分解，相应的会有蛋白质分解产生的腐败味、脂肪分解产生的酸败味，并导致原料乳产气、产酸而变粘稠［2］。因此，芽孢数和耐热芽孢数的多少决定企业制定的产品质量可接受水平（AQL）［3］，可以作为乳粉产品质量控制的一个必要的检测指标。

测量不确定度的评定是实验室质量管理体系的重要组成部分和实验室质量管理的重要内容，测量结果都具有不确定度，当测量结果在标准值附近，客户索要不确定度时，实验室应在出具检查报告中给出不确定度［4］。微生物检测具有非严格性、非度量学和非统计学等有别于一般定量检测的特点，因此本试验单独采用重复性和再现性数据来评定不确定度，但也考虑到了偏离。此外，试样中的微生物一般以单个菌体或菌团的形式存在，其定量检验易受到培养基质量、操作环境、稀释溶液、培养温度、观察结果时间和操作人员技能等因素的影响，使试验检测的结果离散度大，因此采用测试结果取对数的形式用于不确定度的评定。通过本试验的探索和研究一方面可为包括芽孢计数在内的实验室微生物定量检测的准确度和精密度验证提供理论依据和实践指导，另一方面也可为乳制品中芽孢杆菌污染的监控及其可能造成品质问题的预警机制形成一定的理论基础，为建立和完善乳制品生产中的全过程控制技术提供科学依据。

1 材料和方法

1．1 材料与设备

1．1．1 样品

全脂乳粉：市售。

1．1．2 培养基

乳平板计数琼脂（MPC）：青岛海博生物技术有限公司。

1．1．3 主要仪器设备

多功能热风循环烘箱：FED 240型，德国Binder公司；

生化培养箱：SPX－250B－Z型，上海博迅实业有限公司；

生物安全柜：SG603A－HE型，美国Baker公司；

全自动高压蒸汽灭菌器：HV－85型，日本Hirayama公司；

电冰箱：BCD－170型，河南新飞电器有限公司；

生物显微镜：ECLIPSE 80i型，日本Nikon公司；

拍击式均质器：Basic型，西班牙IUL公司。

1．2 方法

1．2．1 检验方法 依据农业部标准《乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定（NY／T 1331－2007）》第二部分进行检验，流程如图1所示。

图1 测定流程Figure1 Protocol of test

1．2．2 数学模型 设需氧芽孢总数为A，试验结果为X，则：A ＝X CFU／g，最佳

1．2．3 不确定度来源及分析 本试验的不确定度主要来源于取样、重复性、培养条件、加热条件、样品保存条件，详细描述见图2［7，8］。

2 结果与分析

2．1 微生物检测不确定度分析的特点

相对于化学物质、物理量值等其他类型的定量分析，微生物检测中由天平最大容许误差、稀释和取样过程等因素引入的不确定度都为对合成不确定度贡献较小的B 类不确定度，可以忽略不计，因此A 类不确定度是需氧芽孢总数测定中主要引起的不确定。

图2 不确定度的分量构成Figure2 Components of uncertainty analysis

2．2 重复测量结果的不确定度评定

对20份试样进行重复检测，由于微生物定量测试的数据发散性较大，直接采用贝塞尔公式计算将得到较大的合并样本标准差，并且在出现较小样本均值的情况下其不确定度反而会较大，因此在这种情况需要对试验结果进行取对数的处理方式，再求得该样本检测结果对数值的均值和残差平方和。表1即是测试的原始数据及其取对数后求得的均值和残差平方和列表。

表1 检验结果及分析Table1 Results and analysis

检测结果对数值标准偏差的合并样本标准差可以通过贝塞尔公式求得：

扩展不确定度：U ＝KUc

取值水平P＝95%，v ＝20，查t分布表得：

2．3 报告结果

本试验的检测结果可以采用平行样对数值的平均值或其反对数值即平行样平均值两种方式表达，前者取值区间在lgX±0．121 8之间，后者则为相对于对数值再取反对数得其取值区间分布。以1号试样为例，其lgX ＝2．241，则其取值区间为［2．119，2．363］，取反对数得两次测量平均值的取值区间为［132，231］CFU／g，那么根据本次测试方法所得的不确定度，第1次测试样品需氧芽孢总数的测试结果可估算区间为［140，240］CFU／g。

3 讨论

全脂奶粉需氧芽孢总数检验中涉及到的重复性、培养条件、取样等因素为对合成不确定度贡献较小的B类不确定度可以忽略不计，以重复测量带来的不确定度为主，因此根据这一情况，本试验采用统计学的方法（A 类）来评定测量的不确定度。

由于芽孢总数检测数据发散性较大，直接采用贝塞尔公式计算将得到较大的合并样本标准差，并且在出现较小样本均值的情况下其不确定度反而会较大，因此应首先通过取对数的方式对本试验产生的数据进行必要的处理之后，其测量不确定度再采用合并样本标准差的方法求得。这种处理方式使用便捷，对于每一个独立的测试对象均适用。此外，即使伴随着样本量的扩大，试验数据的增加，依然可以在任何时候加入到合并样本中，再次求得该合并样本的标准差，从而相应地变更其测量不确定度的取值区间。

对于结果的表达方式，由于扩张不确定度U 只能表示为lgX 的取值区间，因此要得到微生物含量的可能区间须再对其取反对数。

1 陈霞，黄玉军，王琴，等．热处理条件对牛乳中耐热芽孢致死效果的影响［J］．食品研究与开发，2006，32（2）：1～6．

2 韩永霞．牛乳中芽孢杆菌的动态变化及部分生物学特性的研究［D］．呼和浩特：内蒙古农业大学，2006．

3 韩雪，张兰威．芽孢杆菌的检测方法［J］．食品科学，2007，28（1）：347～350．

4 刘丽花，周红，任永红．菌落总数测定中的不确定度评定［J］．现代预防医学，2007，34（17）：317～318．

5 陆霄芳．食品中菌落总数检验结果不确定度分析［J］．疾病监测与控制杂志，2012，6（9）：559～561．

6 李子江，林涛，邓铁娥．游泳池水中距离总数检测确定度评定［J］．疾病监测与控制杂志，2012，6（7）：421～423．

7 王晓红，姜娴．食品中菌落总数检测结果的不确定度评定［J］．中国卫生检验杂志，2011，21（11）：2 799～2 800．

8 凌云，王李宝，沈辉，等．食品中大肠菌群平板计数结果不确定度的评定［J］．食品与机械，2010，26（5）：75～77．