IL－HLLME－HPLC法测定酸奶中磺胺类抗生素

张丽媛 王 颖，2 张东杰

（1．黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2．国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）

食品中兽药残留立法委员会认为兽药的使用在于保障畜牧业稳步发展、增加畜牧产品供应量、减少因动物疾病而带来的经济损失，以及控制人畜共患疾病在动物和人类之间传播等方面［1］。但过量或违规使用，可造成多种直接和间接的危害，主要表现为变态反应与过敏反应、细菌耐药性、致畸作用、致突变性作用及致癌作用［2，3］。

欧盟和美国食品药品管理局已经提出，乳制品中磺胺类抗生素的总残留量不得超过100μg／kg，强调婴儿配方奶粉中必须完全不含磺胺类抗生素，中国农业部规定在乳制品中磺胺甲嘧啶和总的磺胺残留量不得高于25 μg／kg 和100μg／kg［4－6］。目前，乳制品中磺胺类抗生素残留检测存在的两个主要问题：低浓度水平残留和复杂基质干扰［7］，这就迫切需要建立一种快速、有效、高灵敏度的分析目标分析物的方法。样品分析成败的关键是样品的前处理，固相萃取［8，9］、固相微 萃取、基 质 固 相 分 散［10］、分 散 液 液 微 萃 取［11］、浊点萃取［12］等都是新近常用的分析磺胺残留的样品前处理方法。一些灵敏度较高的检测方法也发展起来，例如高效液相色谱法（HPLC）、质谱法［13］等。均相液液微萃取（ILHLLME）是近年来液液微萃取和浊点萃取发展起来的一种新型萃取技术，集采样、萃取、富集于一体，有机溶剂用量非常少。近几年来，被称为“绿色溶剂”的离子液体在分离萃取过程中得到了广泛的应用。离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的、在室温或者室温附近呈液体状态的熔融盐，它完全由离子组成，可以自由调节。用它代替传统的有机溶剂，可以从源头上克服有机溶剂挥发性大、毒性强等的缺点；同时离子液体对水和有机物具有结构可调性，具有选择性溶解能力。本研究拟采用以离子液体为基础的IL－HLLME技术，结合高效液相色谱法对酸奶样品中磺胺类抗生素药物进行分析测定。旨在寻求一种灵敏、绿色的检测方法。

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

1．1．1 主要仪器

高效液相色谱仪：Agilent1200 型，带有多波长检测器，美国安捷伦技术有限公司；

Eclipse XDB－C18柱：150mm×4．6mm，3．5μm，美国安捷伦技术有限公司；

超声振荡器：KQ2200E型，中国昆山仪器有限公司；

高速离心机：Allegre 64R 型，美国贝克曼公司；

纯水净化仪：Milli－Q 型，法国Millipore公司。

1．1．2 主要试剂

磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMI）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）：纯度均大于98%，美国Sigma公司（化学结构见图1）；

图1 磺胺类抗生素的化学结构式Figure1 The chemical structures of sulfonamide antibiotics

乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；

甲酸、磷酸、乙醇、丙酮：分析纯，北京化学试剂厂；

1－乙基－3甲基咪唑四氟硼酸盐（［C2MIM］［BF4］）、1－丁基－3甲基咪唑六氟磷酸盐（［C4MIM］［PF6］）：纯度＞98%，上海成捷化学试剂公司；

1－己基－3甲基咪唑六氟磷酸盐（［C6MIM］［PF6］）：纯度＞97%，上海成捷化学试剂公司；

1－丁基－3甲基咪唑四氟硼酸盐（［C4MIM］［BF4］）、1－辛基－3甲基咪唑六氟磷酸盐（［C8MIM］［PF6］）：纯度＞99%，上海成捷化学试剂公司；

磷酸铵（NH4PF6）：98%，上海成捷化学试剂公司。

1．1．3 样品

伊利原味、蒙牛原味、完达山原味、龙丹原味4种酸奶样品：大庆市某超市。

1．2 试验方法

1．2．1 标准溶液的配制 磺胺嘧啶（SD）、磺胺甲基嘧啶（SMI）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）、磺胺甲噁唑（SMZ）分别用乙腈溶解，制成500μg／mL的标准溶液，于4 ℃下保存。标准混合溶液浓度为10μg／mL。工作标准溶液通过用乙腈稀释标准混合溶液获得，现用现制。

1．2．2 试验过程 准确移取10mL 酸奶加入10mL 纯水，振荡2 min，混合均匀；取5 mL 混合后的样品溶液放入10mL的聚四氟乙烯离心管中，依次在离心管中加入20μL磷酸溶液和70μL［C6MIM］［PF6］（萃取剂），混合后强烈振荡5min。然后加入100μL 的［C4MIM］［BF4］（分散剂），在35 ℃下超声萃取10min。再准确称取0．10g的NH4PF6加入到超声后的样品溶液中，再次超声振荡2min，此时离心管中的溶液形成一个水／分散剂／萃取剂的乳浊液体系，目标分析物迅速地由水相转移到离子液体相并且达到两相平衡。平衡后的乳浊液在5 ℃，15 000r／min条件下，离心10min，溶液分层，萃取相沉积到离心管的底部。将上部的水相溶液完全吸除，用50μL 微量注射器将离子液体相完全转移到1．0mL的离心管中，再用0．1%甲酸的乙腈溶液稀释到200μL作为目标分析溶液，将此分析溶液均匀超声2 min，过0．22μm 滤膜后，进行HPLC分析。

1．2．3 色 谱 条 件 色 谱 柱：Eclipse XDB－C18色 谱 柱（150mm×4．6mm，3．5μm）；柱温：35 ℃；流动相：A（0．1%甲酸的乙腈溶液）和B（pH 3，0．1%甲酸的水溶液），梯度洗脱条件见表1；流动相流速：0．5 mL／min；进样量：20μL；检测波长：265nm；参比波长和狭缝宽度分别为360，4nm。

表1 梯度洗脱时间程序Table1 Time procedure of gradient elution

2 结果与讨论

2．1 萃取条件的优化

2．1．1 样品溶液pH 值的影响 由于溶液的pH 值会影响磺胺类抗生素的电离状态和溶解度，也会影响酸奶样品中蛋白质的沉淀情况，所以试验考察样品溶液的pH 值。在强酸和强碱条件下磺胺类抗生素的溶解度很大，萃取率较低，故选取pH 值在3．0～9．0范围进行考察。由图2可知，当pH

表3 样品分析Table3 Analytical results of samples

3 结论

本试验建立了基于离子液体的均相液液微萃取方法，并且成功地从酸奶样品中萃取出4种磺胺类抗生素，方法简便可行，取得了良好的效果。

1 Reynolds L，Mckee M．Factors influencing antibiotic prescribing in China：An exploratory analysis［J］．Health Policy，2009（90）：32～36．

2 Forti A F，Scortichini G．Determination of ten sulphonamides in egg by liquid chromatography–tandem mass spectrometry［J］．Analytica Chimica Acta，2009（637）：214～219．

3 M J García－Galán，M S Dáaz－Cruz，D Barceló．Combining chemical analysis and ecotoxicity to determine environmental exposure and to assess risk from sulfonamides［J］．Trends in Analytical Chemistry，2009（28）：804～819．

4 Hermo M P，Nemutlu E，Kir S，et al．Improved determination of quinolones in milk at their MRL levels using LC－UV，LCFD，LC－MS and LC－MS／MS and validation in line with regulation 2002／657／EC［J］．Analytica Chimica Acta，2008（613）：98～107．

5 Huang X J，Qiu N N，Yuan D X．Simple and sensitive monitoring of sulfonamide veterinary residues in milk by stir bar sorptive extraction based on monolithic material and high performance liquid chromatography analysis［J］．Journal of Chroatography A，2009（216）：8 240～8 245．

6 张丽媛，姚笛，何莹，等．固相萃取－高效液相色谱法联用检测花椒样品中的玫瑰红B［J］．黑龙江八一农垦大学学报，2012（6）：53～57．

7 包锦渊，迟晓峰，董琦，等．分散均相微萃取－高效液相色谱法测定蜂蜜中的磺胺类抗生素［J］．光谱实验室，2012，3（29）：1 934～1 937．

8 杨方，李耀平，钱疆，等．固相萃取－梯度洗脱高效液相色谱法同时检测饲料中十三种磺胺类药物［J］．分析测试技术与仪器，2004，4（10）：234～237．

9 吴平谷，冯靓，王强，等．固相萃取结合高效液相色谱测定鸡肉中10 种磺胺类药物残留［J］．中国卫生检疫杂志，2008，11（18）：2 201～2 203．

10 余辉菊，杨晓松，郑萍，等．基质固相分散－高效液相色谱法测定牛奶中的8 种磺胺类药物残留［J］．中国卫生检疫杂志，2009，1（19）：86～89．

11 段劲生，王梅，孙明娜．基质固相分散在农药残留分析中的应用研究进展［J］．农药，2006，8（45）：508～511．

12 余益军，孙兆海，于红霞，等．浊点萃取在环境有机分析中的影响因素及应用［J］．理化检验－化学分册，2008（44）：696～700．

13 王浩，郭启雷，殷晓燕，等．高效液相色谱－串联三重四极杆质谱对牛奶中10种磺胺类药物残留的同时测定［J］．分析测试学报，2008（27）：137～139．