三种酚酸对α－淀粉酶的抑制作用

宋 媛 周池虹伶 欧仕益

（1．暨南大学附属第一医院校门诊部，广东 广州 510632；2．暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）已逐渐成为继心血管病、肿瘤之后严重威胁人类健康的第三大疾病［1］。在糖尿病人中，超过90%的病人属于Ⅱ型糖尿病（非胰岛素依赖型糖尿病），这类病人不需要胰岛素的治疗，仅用饮食调节即可有效控制血糖［2］。在饮食调节无效的情况下就需增加药物治疗，其中α－葡萄糖苷酶抑制剂具有较好的疗效，被认为是Ⅱ型糖尿病的首选药和Ⅰ型糖尿病的胰岛素治疗的辅助药物［3］。其作用机制：可竞争性地抑制寡糖的分解，延缓了双糖、低聚糖及多糖分解为葡萄糖，从而降低餐后血糖［4］。

目前，医学界公认疗效较好的α－葡萄糖苷酶抑制剂就是通过抑制α－淀粉酶的活性来达到治疗目的，α－淀粉酶抑制剂是属于糖苷水解酶抑制剂中的一种，它因能阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，减少糖分的摄取，降低血糖和血脂含量水平值而被广泛研究［5］。α－淀粉酶和α－葡萄糖苷酶抑制剂的制备大多采用微生物发酵法，原料来源少，生产成本高，因此，有必要从天然药物原料中寻找安全高效的α－淀粉酶抑制剂来防治糖尿病。

酚酸类化合物是一类含有酚羟基和羧基的一类物质，研究［6－8］表明，酚类物质能与蛋白相互作用从而影响酶的活性。绿原酸是由咖啡酸和奎尼酸组成的一类缩合酚酸，是金银花、杜仲等中药材的活性成分，具有抗氧化、保护心血管、抗诱变、抗癌、抗菌、抗病毒、降脂降糖和免疫调节等作用［9］。阿魏酸的化学名称为4－羟基－3－甲氧基肉桂酸，是当归、川芎等中药材的活性成分，具有抗氧化、抗血栓、降脂、抗菌消炎、抗突变和预防癌肿等作用［10］。对－香豆酸的化学名称为4－羟基肉桂酸，是杜仲叶的有效成分之一，具有抗氧化、抗菌和抗突变、镇痛、镇静、利胆、调节免疫、提高精子活力、抑制黑色素形成、预防由亚硝酸盐引起的结肠炎等作用，能有效降低心血管疾病的发病率［11，12］。阿魏酸和绿原酸已被卫生部批准为保健食品原料［13］，是一类安全、无害的物质。关于3种酚酸协同对α－淀粉酶活性的影响目前未见报道。因此本研究拟选用阿魏酸、绿原酸、对－香豆酸3种酚酸协同研究其对α－淀粉酶的抑制作用，以期开发一类新型α－淀粉酶抑制剂用作糖尿病人的功能性食品。

1 材料与方法

1．1 材料与试剂

可溶性淀粉、苯酚、葡萄糖：AR 级，天津市大茂化学试剂厂；

α－淀粉酶：2 000U／g，广东环凯微生物科技有限公司；

阿魏酸、对－香豆酸：98%，广州市齐云生物技术有限公司；

绿原酸：97%，远航生物技术有限公司；

磷酸氢二钠：AR 级，天津市化学试剂厂；

吐温20：CP级，天津市福晨化学试剂厂；

磷酸二氢钾、氢氧化钠、酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠：AR级，天津市福晨化学试剂厂；

3，5－二硝基水杨酸（DNS）：AR 级，国药集团化学试剂有限公司。

1．2 仪器与设备

水浴恒温振荡器：SHA－B型，江苏金坛市医疗仪器厂；

低速离心机：KDC－1044型，科大创新股份有限公司中佳分公司；

紫外可见分光光度计：UV－9600型，北京瑞利分析仪器公司；

精密电子天平：HR－200型，广州市艾安德仪器有限公司；

电子天平：MP5002B型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

电磁炉：KY－PC113A－L型，松下电器（中国）有限公司。

1．3 方法

1．3．1 酚酸对α－淀粉酶活力的影响 用0．05 mol／L 磷酸盐缓冲液（pH＝6．5）分别配制质量浓度为2 U／mL 的α－淀粉酶液和40 mg／mL 的可溶性淀粉溶液，以及质量分数为0．1%，0．2%，0．4%的阿魏酸、绿原酸、对－香豆酸溶液（配制时，加入体积分数2%的吐温20使酚酸完全溶解）。

取100mL三角瓶，各加入10mL酶液和25mL酚酸溶液，在37 ℃的恒温振荡器振荡（100r／min）保温5min后，加入25mL的可溶性淀粉溶液，再将其在37 ℃的恒温振荡器振荡（100r／min）反应30 min，取1 mL 样液于离心管中，加入1mol／L 的氢氧化钠1 mL 终止酶促反应，稀释5 倍，离心，取1mL上清液，用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖，各处理重复3次。

1．3．2 酚酸混合物对α－淀粉酶活力的影响 在1．3．1研究结果的基础上，选择不同浓度的3 种酚酸复配，观察其对α－淀粉酶的抑制作用。

1．3．3 淀粉酶抑制率的计算

2 结果与分析

2．1 3种酚酸单独存在时对α－淀粉酶活力的影响

不同浓度的3种酚酸对α－淀粉酶活力的影响见表1。由表1可知，酚酸种类和浓度对α－淀粉酶活力的影响很大。阿魏酸添加量为0．02%时对α－淀粉酶有微弱的促进作用，随着添加浓度的增加，抑制作用增加；浓度再进一步增加时抑制效果反而下降。绿原酸在添加量为0．05%时抑制作用达到最高，而后随着添加量的增加抑制效果下降；香豆酸的影响趋势与绿原酸近似，但添加量大于0．2%时反而提高α－淀粉酶活力。

表1 不同质量浓度的酚酸对α－淀粉酶的抑制百分率Table1 Effect of different concentrations of phenolic acids on the inhibition ofα－amylase（n ＝3） ／%

阿魏酸和香豆酸是纤维质中含有的酚酸，研究阿魏酸和香豆酸对纤维素酶和木聚糖酶的影响有些报道。研究［14，15］发现，高浓度的酚酸（10～50mM）会抑制纤维素酶和木聚糖酶活性，而低浓度的酚酸则提高这两种酶的活性［16］。本课题组［17］曾采用紫外、荧光和圆二色谱研究发现，酚酸的加入会影响纤维素酶的空间结构，降低α螺旋含量，增加β折叠和无规线团含量。因此，适当浓度的酚酸可增加纤维素酶的柔性，提高酶的活力。同时，酚酸可和酶活性中心所含芳香族氨基酸反应，从而降低酶的活性，因此酚酸究竟是促进还是抑制纤维素酶活性，关键取决于其添加浓度。

由于α－淀粉酶能催化淀粉α－1，4糖苷键水解，而酚酸对α－淀粉酶的作用机制可能与其对纤维素酶和木聚糖酶的作用机制类似。本研究发现，浓度为0．05%的阿魏酸、绿原酸以及对－香豆酸对α－淀粉酶的抑制百分率较高。这也提示在此浓度下这3 种酚酸对α－淀粉酶抑制作用较大，在此基础上，进一步探究3 种酚酸同时添加时对α－淀粉酶的抑制作用。

2．2 3种酚酸复配对α－淀粉酶活力的影响

由表1结果可知，酚酸浓度对α－淀粉酶活力影响很大。故将酚酸总浓度控制在0．2%以下进行复配添加，研究了其对α－淀粉酶活力的影响，结果见表2。

表2 不同浓度酚酸复配后对α－淀粉酶的抑制作用Table2 Effect of mixture of phenolic acids on the inhibition ofα－amylase（n ＝3） ／%

由表2可知，在合适的浓度下，3种酚酸对α－淀粉酶的抑制表现出协同作用，抑制率为12．62%～98．77%；当阿魏酸、绿原酸和对－香豆酸的质量浓度分别为0．07%，0．05%和0．04%时，α－淀粉酶活力几乎完全被抑制，抑制率达到98．77%。

3 结论

酚酸混合液具有较好的协同抑制作用。与纤维素酶和木聚糖酶的活性中心氨基酸组成不同，淀粉酶活性中心没有芳香族氨基酸，因此酚酸对α－淀粉酶的的协同作用机理还有待进一步探讨。

酚酸类化合物是一类含有酚羟基和羧基的一类物质，酚类物质能与蛋白相互作用从而影响酶的活性。通过体外试验研究，表明阿魏酸、绿原酸、对－香豆酸这3 种酚酸的混合液在一定浓度范围内能够抑制α－淀粉酶的活力。3 种酚酸在质量浓度为0．05%时，具有较好的抑制效果；当阿魏酸、绿原酸和对－香豆酸分别按0．07%，0．05%和0．04%的质量浓度混合添加时，对α－淀粉酶抑制率达到98．77%，表明这3种

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