苏云金芽胞杆菌基因组研究

喻子牛，王阶平，何 进

(农业微生物学国家重点实验室农业部农业微生物资源利用重点实验室华中农业大学生命科学技术学院，湖北武汉 430070)

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)广泛分布于土壤、水、尘埃、昆虫尸体和植物等生境中，是一种典型的革兰阳性菌，营养体呈杆状，在稳定期后期开始形成一个卵圆形的芽胞(spore)，伴随芽胞的形成，在菌体内同时形成一个或多个不同形态的伴胞晶体(parasporal crystal)，这是区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的显著特点［1］。苏云金芽胞杆菌的伴胞晶体是由不同的的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)组成的，不同菌株产生不同种类的 ICPs。至今，已发现的760个ICPs被归为72个 Cry群和3个 Cyt群。ICPs的多样性赋予其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、同翅目等昆虫，以及动植物线虫、蜱螨等节肢动物甚至癌细胞都有特异性的毒杀活性，而对非目标生物安全［2］。因此，目前苏云金杆菌商品制剂已达100多种，是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂。一系列的研究也提示苏云金芽胞杆菌是已知的最安全的微生物制品之一［3］。近年来，在转基因作物中成功表达了一些ICPs而赋予其可遗传的抗虫能力，不仅提高了产量而且极大地减少了化学农药的使用［4］。此外，苏云金芽胞杆菌还产生具有广谱杀虫活性的苏云金素(thuringiensin)［5］、抗病作用的双效菌素(zwittermicin A)［6］等。近几年，国内外研究人员在苏云金芽胞杆菌的基因组学和功能基因组学领域开展了大量而深入的研究，并取得了丰富的研究成果。本文拟就苏云金芽胞杆菌的基因组研究进展进行简要论述。

1 苏云金芽胞杆菌基因组测序

2004年6月30日美国能源部联合基因组研究所宣布完成了苏云金芽胞杆菌serovar konkukian 97－27 的全基因组测序工作［7］。konkukian 97－27是从人体的坏死骨组织上分离得到的，通过动物活性测试实验表明它能引起与炭疽热类似的疾病［8］。系统发生树分析结果显示该菌与炭疽芽胞杆菌很接近，但konkukian 97－27的生理生化指标与苏云金芽胞杆菌更为相似，该菌株并不具有任何杀虫活性，其全基因组序列中也不含有与杀虫毒性相关的编码基因。因此，尽管konkukian 97－27是第一个完成全基因组测序的菌株，但它并不是一株典型意义上的苏云金芽胞杆菌。

随着研究的深入，特别是第二代测序技术的应用，有大量的苏云金芽胞杆菌菌株进行了基因组测序。至2013年3月底，已有26株苏云金芽胞杆菌完成全基因组测序工作，1株正在进行拼接，另有26株苏云金芽胞杆菌(包括华中农业大学的 3 个菌株 YBT－1518、YBT－1520 和 YBT－1765)的全基因组测序正在进行中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/486)。在已完成全基因组测序的苏云金芽胞杆菌中，华中农业大学完成测序工作的菌株包括BMB171［9］、YBT－020［10］和 CT－43［11］。

2 苏云金芽胞杆菌基因组结构及特征

苏云金芽胞杆菌染色体为环状DNA，基因组全长为5.31 ～6.77 Mb不等，GC 含量在34.5% ～35.6% 之间［7，9－11］。下面分别介绍已完成全基因组测序的几个典型菌株基因组结构及特征。菌株konkukian 97－27 基因组全长5.31 Mb，包括2 个复制子:1个环状染色体，编码至少5 198个开放阅读框，1个质粒pBT9727;没有发现任何与cry、cyt或vip基因有同源性的基因［7］。菌株Al Hakam基因组为5.31 Mb，包括2个复制子:1个环状染色体(5.26 Mb)编码 4 969个 ORFs，1个质粒pALH1;也没有发现与cry、cyt或vip基因具有同源性的基因［12］。菌株 CT－43是第1株完成全基因组测序的含杀虫晶体蛋白基因的苏云金芽胞杆菌菌株，基因组全长6.15 Mb，包括11个复制子:1个环状染色体(5.26 Mb)，编码5 529个 ORFs，和10个环状质粒共编码737个ORFs;它至少产6种毒素蛋白(Cry1Aa3、Cry1Ba1、Cry1Ia14、Cry2Aa9、Cry2Ab1和Vip3Aa10);还编码104个tRNAs基因和13个rRNA 操纵子［11］。菌株 YBT－020的全基因组包括3个复制子:1个环状染色体(5.35 Mb)编码5 477个ORFs，2个环状质粒，分别编码200和149个ORFs;染色体的GC含量为35.5%，2质粒的GC含量分别为33.1%和33.9%;基因组编码107个 tRNAs基因和14个 rRNA操纵子［10］。无晶体突变菌株BMB171的全基因组长5.64 Mb，包括2个复制子:1个环状染色体(5.33 Mb)编码5 088个ORFs和1个环状质粒 pBMB171编码276个ORFs;基因组编码104个tRNAs和14个rRNA操纵子［9］。菌株 YBT－1520是高毒力菌株，尽管还没有获得基因组精细图，但是已经获得完成图:1个环状染色体，大小约为5.4 Mb，共编码5 556个ORFs;10个质粒，含有5种杀虫晶体蛋白基因，主要集中在质粒 pBMB293上(数据未发表)。

3 苏云金芽胞杆菌的质粒

苏云金芽胞杆菌的重要特性是含有丰富多样的内生质粒，其质粒DNA的含量占到细胞总DNA的10%～20%。在NCBI中共有23个质粒提交了全序列。不同亚种，甚至同一亚种不同菌株所携带质粒的数量和分子大小差异很大，从1个到多达14个，分子大小由2 kb到250 kb不等。其中，菌株YBT－1520含有大小从2 kb到416 kb的11个质粒;质粒拷贝数从1.38到172，且与质粒大小成反比;在菌株的对数生长中期，质粒的总DNA 含量(约8.7 Mb)是染色体DNA含量(约5.4 Mb)的 1.62 倍［13］。

我们的研究表明，菌株CT－43的10个质粒所编码的基因大多数是功能未知的，但包括大量的与结合转移、转座、插入等相关的转座酶与整合酶。CT－43中最值得关注的是pCT281和pCT127这2个大质粒。首先，赋予CT－43杀虫活性的6个毒素蛋白的编码基因分别位于这2个质粒上:cry1Aa3、cry1Ia14、cry2Aa9、cry2Ab1 和 vip3Aa10 位于pCT281的毒力岛上，而Cry1Ba1位于pCT127上。第二，苏云金素的生物合成基因簇位于pCT127上［5］。第三，成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白是针对噬菌体、质粒等外源DNA的获得性和可遗传的免疫系统，已成为微生物学研究的新的热点领域;我们在pCT281上不仅发现了2个CRISPR座位，还找到了7个 CRISPR相关蛋白:1个 Cas5和6个Csd2［14－15］。第四，我们发现在 pCT281 上存在1 个可能在同类相残(cannibalism)［16］中发挥功能的基因簇 pCT281.250－254。

4 蜡状芽胞杆菌群的比较基因组

在蜡状芽胞杆菌群中，苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌具有较高的DNA同源性和相似的形态特征，关系密切。尽管这3种细菌具有非常显著的表型差异:苏云金芽胞杆菌为昆虫致病菌、蜡状芽胞杆菌为食源性条件致病菌、炭疽芽胞杆菌为人和动物炭疽病原菌［17］，但是它们的基因组具有很高的序列同源性和共线性。炭疽芽胞杆菌、蜡状芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的主要区别在于所携带质粒的不同［18］。例如，苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌的差别仅在于前者在形成芽胞时可以产生伴胞晶体，而伴胞晶体有毒性质粒编码，一旦该质粒丢失，苏云金芽胞杆菌可以转变为蜡状芽胞杆菌。因此，基于16S rRNA，16S～23S rRNA基因间区的方法都很难区分3种菌，目前普遍使用的方法是运用多基因标签(如AFLP，MLST，MLEE等)的方法来进行聚类分析［19－21］。

虽然苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌是不同种还是同一种间的不同分支现在仍无定论，但是在蜡状芽胞杆菌群中，炭疽芽胞杆菌因其是炭疽病的病原菌而最受人们关注。早期，人们认为炭疽芽胞杆菌区别于其他蜡状芽胞杆菌群细菌的主要特点在于:炭疽芽胞杆菌存在4个前噬菌体、plcR调节因子的无义突变、pXO1和 pXO2 质粒［17，22－23］。但我们的研究表明，苏云金芽胞杆菌也含有多个前噬菌体(CT－43有6个前噬菌体)。有些菌株不存在plcR调节因子的无义突变，却存在与pXO1和pXO2相似的质粒［24］。最近，通过45个菌株的比较基因组学研究，仍然没有发现炭疽芽胞杆菌具有明显的基因缺失或积累现象［25］。尽管如此，炭疽芽胞杆菌致病性相关的基因是在进化史上近期通过基因水平转移而获得的观点得到广泛认同的［25］。

5 苏云金芽胞杆菌转录组

我们通过Illumina高通量测序(RNA－seq)技术分析了CT－43菌株的转录组学［26］。去低值后，获得的净 reads平均读长为110 nt，7、9、13 和22 h这4个样品的总净 reads数分别为 926755、1096665、577810和1493721。这样，4个时期样品的测序覆盖度达到了10到27倍，均获得了理想的测序深度。结果表明，CT－43染色体编码的ORFs在4个时期的转录比率分别为40.9%、43.1%、53.2%和 17.7%，说明 13 h 的转录最为活跃。

显然，保持转录和翻译机器的高效运转对芽胞和伴胞晶体的形成是至关重要的。我们的研究结果表明，RNA聚合酶复合物的δ和ω亚基、冷休克蛋白、Sig因子和转录因子以不同的机制协同地进行转录调节。重要的是，在芽胞形成期，核糖体蛋白、tRNA、rRNA的差异加工和修饰加之翻译抑制作用的解除极大地加快了核糖体的周转和组装速率，提高了翻译起始、延伸和终止效率，因而可以补偿核糖体数量上的减少。RNA－seq结果显示，大多数cry基因和芽胞结构、组装与成熟相关的基因在芽胞形成期特异性表达。在母细胞裂解之前，细胞团的解聚是首先发生的重要事件，除了一些水解酶和蛋白酶外，D－氨基酸和某种精胺也一起参与细胞团的解聚。在母细胞裂解的过程中，许多在22 h特异表达和显著上调的基因先后发挥功能而实现细胞膜的破裂、细胞壁的崩解以及DNA的降解。

我们研究发现，在芽胞形成期许多蛋白酶和氨基酸代谢(特别是支链氨基酸)变得更加活跃。对数期储存的聚β－羟基丁酸和羟基丁酮、一些“低质”原料和非产芽胞细胞的裂解(同类相残)一起为芽胞和伴胞晶体的形成提供大量的碳源和能源物质。而且，当 CT－43生长在 GYS培养基时，磷酸戊糖途径就会呈现出一个十分有趣的调节现象。特别提出的是，三羧酸循环在芽胞形成期被明显修正与补充。与通过电子传递系统产生能量相关的酶和色素在数量上显著增加。最后，ATP合成酶(F0F1－ATPase)的大多数亚基在芽胞形成期显著上调。

我们的研究结果首次从转录组水平系统地揭示:①与芽胞和伴胞晶体形成、芽胞成熟和母细胞裂解相关的基因表达调控机制;②与芽胞和伴胞晶体形成相关的氨基酸、能源物质来源和能量供应的代谢调控机制［26］。

6 苏云金芽胞杆菌蛋白质组

蛋白质组学的研究范围已扩大到研究动物、植物和微生物等领域。近年来，苏云金芽胞杆菌蛋白质组学的研究越来越多，以研究杀虫晶体蛋白在昆虫中肠的刷状缘膜囊泡中的结合受体、研究杀虫毒素在昆虫中肠的结合蛋白。这些研究能够更好地了解毒素在昆虫中肠的作用机理，对进一步研究杀虫晶体蛋白的作用机制及昆虫抗性的产生都有重要的意义。我们对菌株YBT－1520进行高温条件下蛋白质组学研究，结果表明，在42℃处理后某些与芽胞和杀虫晶体蛋白形成有关的蛋白表达会下调［27］。蛋白质组学研究主要是针对蛋白质的研究，与苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的产生相关的蛋白已鉴定出很多，对高产苏云金素的苏云金芽胞杆菌野生菌株CT－43、高产突变菌株CT－43－1C及不产突变菌BMB0806在蛋白表达水平的差异研究显示，在菌株BMB0806中发现有6个蛋白质可能与苏云金素合成或代谢相关，这为研究苏云金素合成基因簇的克隆和合成途径提供了有力的证据［28］。最近，我们通过蛋白质组学研究还揭示了苏云金芽胞杆菌不同生长时期的代谢途径规律，以及PHB代谢对芽胞和伴胞晶体形成的影响［29－30］。

7 苏云金芽胞杆菌代谢组

代谢组学(metabolomics)是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的新兴学科。对苏云金芽胞杆菌菌株YBT－1532产生的苏云金素的代谢调控的研究提出，苏云金素的生物合成代谢与腺嘌呤从头合成途径有关［31］，可以通过提高腺嘌呤的合成前体—甲酸钠的浓度来增加苏云金素的产量。苏云金芽胞杆菌代谢方面的研究不再局限在发酵研究上，也有对某条代谢途径的研究，蜡状芽胞杆菌群能够分泌铁载体，但是蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌能分泌2种铁载体:petrobactin和bacillibactin，而能产生杀虫晶体蛋白的苏云金芽胞杆菌菌株ATCC 33679只能分泌bacillibactin，这是由于编码铁载体基因的bacACEBF操纵子上缺乏asbB基因所导致，据推测其中一种铁载体petrobactin与柠檬酸循环有关，进而影响杀虫晶体蛋白基因的表达，这些结果为研究杀虫晶体蛋白的形成机制提供了新思路。

代谢组学不仅在代谢网络模型、代谢网络结构和功能分析以及微生物发酵中越来越重要，而且在代谢工程研究和生化工程控制中发挥重要作用。更为重要的是，从基因组重建得到代谢网络的代谢途径分析［32］，将在未来的系统生物学研究中确定物种的性质，在代谢工程研究中，通过控制代谢途径上的关键酶或改变影响该代谢途径的外界因素，控制代谢流向，促进或抑制某条代谢途径，提高其利用率，指导工业生产等方面发挥更加重要的作用。

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