16S rDNA扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用

朱诗应，戚中田

第二军医大学微生物学教研室，上海市医学生物防护重点实验室，上海 200433

细菌检测包括传统的形态学检查、分离培养、生化鉴定、免疫分析等多种方法，其中细菌的分离培养最为关键，但对苛养菌及生长缓慢的细菌分离培养很棘手。近年来，各种基因诊断技术在细菌检测中不断开发、利用，尤其是基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的基因诊断技术发挥着越来越重要的作用。本文就细菌核糖体小亚基16S RNA的基因(16S rDNA)在细菌鉴定与分类中的应用研究进展作一综述。

1 16S rDNA

16S rDNA是编码原核生物16S rRNA的基因，长度约1 500 bp，存在于所有细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌等原核生物的基因组中，由多个保守区(conserved region)和与之相间的多个可变区(variable region)组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异[1]；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异性。PCR扩增16S rDNA包含两层含义：在保守区设计PCR通用引物，理论上可将存在于待测标本中的各种细菌都扩增出来；若选择可变区设计PCR特异性引物，则可将标本中的细菌鉴定到属、种乃至菌株水平。因此，16S rDNA已成为细菌鉴别与分类研究中较理想的靶序列[2]。

2 基于16S rDNA可变区序列的应用研究

细菌16S rDNA中含有9个可变区[3]，命名为V1～V9区。确定某个可变区内具有细菌种特异性的序列就可能获得细菌实验室诊断的有用靶点。除V2、V3、V4区稍长外，其他各高变区序列都很短，没有哪个高变区能区分所有细菌[4]。Chakravorty等[5]对110种细菌(分别来自于人体、环境及美国疾病预防控制中心鉴定的致病菌)共113份完整的16S rDNA的V1～V8区序列进行详细研究，分别构建了基于V1～V8区序列的特异性系统树(dendrogram)。结果显示，V1区能区分金黄色葡萄球菌与血浆凝固酶阴性葡萄球菌；V2和V3区能将除肠杆菌科以外的细菌鉴别至属的水平，V2区尤其适合于鉴别分枝杆菌属内的菌种，V3区能很好区别嗜血杆菌属内各种细菌；V6区也能区分除肠杆菌科以外的大多数菌种，特别是通过单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析可将炭疽芽胞杆菌从与其生物学性状非常相似的蜡样芽胞杆菌群细菌中区分开来；而通过V4、V5、V7和V8区序列来鉴别细菌至属或菌种的可能性不大。Jacob等[6]收集了31株弗朗西斯菌属的细菌及96份临床分离株，通过对16S rDNA V1区37个核苷酸片段的PCR扩增和测序，不仅能将临床或环境标本中的弗朗西斯菌属成功鉴定出来，结合SNP分析(根据第12位核苷酸T/G不同)还可将弗朗西斯菌属的细菌分成2个组，引起人类和动物土拉热病的土拉热弗朗西斯菌(Francisellatularensis)的3个亚种均在第1组，其他几个菌种则全在第2组。因此，该方法可快速甄别具有强传染性的土拉热弗朗西斯菌。

3 基于16S rDNA全长或部分序列的应用研究

3.1 用于鉴定难以培养的细菌

20世纪90年代初，Relman等[7]针对杆菌性血管瘤(bacillary angiomatosis)的细菌培养与鉴定一直未获成功的难题，采用PCR方法从患者组织标本中扩增细菌16S rDNA片段，并通过测序和比对分析，首次成功鉴定出该血管瘤的病原菌为伏尔希尼立克次体(Rochalimaeaquintana)。1992年又用同样方法鉴定出惠普尔病(Whipple’s disease)的病原菌为一种放线菌，并根据种系进化图谱研究将其系统命名为Tropherymawhippelii[8]。何亮等用PCR从恒河猴阴道分泌物的厌氧菌培养物中扩增出特异片段，经序列分析成功检测出与细菌性阴道病密切相关而用一般方法难以纯培养的动弯杆菌[9]。在心内膜炎的细菌学诊断中，传统的血培养或心瓣膜细菌培养阳性率很低。Marín等[10]对177份心瓣膜标本进行细菌16S rDNA通用引物定量PCR扩增与测序，结果表明定量PCR检测的敏感度、特异度、阴性预期值和阳性预期值分别达到96%、95.3%、98.4%和88.5%，该法可为心内膜炎的及时处理和抗生素的合理选择提供参考依据。

3.2 用于区分进化关系密切的细菌

炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌三者基因序列的同源性>99%，相互之间鉴别较难，被称为蜡样芽胞杆菌群(Bacilluscereusgroup)，甚至有学者认为三者属于同一个种[11]。Sacchi等[12]对不同地区的107株细菌(包括86株炭疽芽胞杆菌、10株蜡样芽胞杆菌和11株苏云金芽胞杆菌)进行全长16S rDNA的扩增和测序，发现在全长1 554 bp序列中存在8处SNP差异，据此可分为不同16S基因型，86株炭疽芽胞杆菌均属其中的第6型。在198份待测临床标本中检测出该基因6型阳性标本7份，而这7份标本均来自于临床确诊的炭疽患者。结果显示，16S rDNA测序方法不仅可将这3种关系相近的芽胞杆菌准确区别开来，还能直接对临床标本进行检测，适合于生物恐怖事件中对炭疽芽胞杆菌的快速鉴定。结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)内的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌等细菌虽然存在明显的表型(phenotype)差异和致病性差异，但通过对结核分枝杆菌ATCC 27294株、牛分枝杆菌ATCC 19210株、非洲分枝杆菌ATCC 25420株的16S rDNA扩增和测序，发现三者16S rDNA没有任何碱基差异，基因型(genotype)完全相同，据此将它们确定为一个种内的不同亚种(subspecies)[13]。

3.3 用于鉴定血液培养的细菌

王永智等[14]在对20余种致病菌进行16S rDNA多序列比对的基础上，设计扩增细菌16S rDNA的荧光定量PCR通用引物，检测血液细菌污染模拟标本，灵敏度可达105CFU/ml。应燕玲等[15]通过13种标准菌株建立了一种基于16S rDNA全长特异性扩增和测序的方法，利用与GenBank数据库比对，成功鉴定出血制品污染的11种未知细菌。Horvat等[16]报道1例患者第2次住院时RapID全自动细菌鉴定仪鉴定其血培养均为苍白杆菌，但改用Vitek全自动细菌鉴定仪检测，结果显示其为羊布鲁菌。作者扩增该菌的全长16S rDNA并进行测序，发现其序列与SmartGene数据库中25个布鲁菌序列100%同源，后经美国疾病预防控制中心确定其血清型为猪布鲁菌。Dash等[17]对1例患者的分离菌株进行16S rDNA测序，纠正了原来用MicroScan Walk-Away细菌鉴定仪作出的错误结果，最终确定其为羊布鲁菌。这些研究提示，目前使用的全自动细菌鉴定仪在鉴定布鲁菌时可能出现差错，最终确认有必要对分离株进行16S rDNA测序。

美国Maastricht大学医学中心研究的实时定量16S rDNA PCR扩增系统，利用通用探针外加种或属特异性探针的多探针法(multiprobe assay)，能在2 h内对血液感染中常见的几种细菌包括革兰阴性的假单胞菌、大肠埃希菌及革兰阳性的葡萄球菌、肠球菌、链球菌等进行快速鉴定[18]。该作者还建立了测定细菌对抗生素敏感度的半定量方法，将血培养阳性标本分别加入不同的抗生素37 ℃培养6 h后，再用定量PCR检测细菌16S rDNA，其对应的循环阈值(cycle threshold, Ct)大小反映细菌生长抑制程度，据此判断细菌对某种抗生素是敏感或耐药。该法对血液感染细菌的鉴定及药敏试验能在1 d内完成，与常规培养及药敏方法至少需2～3 d相比，在病原诊断和抗生素选择方面具有快速优势，有助于菌血症或败血症患者的及时救治[19]。

3.4 用于发现细菌新种类

临床实验室碰到一些新的细菌，因不能明确种类，常难以评估其潜在的致病性。一般而言，2株菌若16S rDNA全长的同源性≥99%，为同种细菌；若在97%～98.9%，一般为同属不同种；若<95%，则为不同属。Woo等[20]报道，2001～2007年全球通过16S rDNA测序已发现细菌新种多达215个，分别属于29个菌属，其中15个为新的菌属，在这15个新属中就包括了100个新种，如Streptococcussinensis、Laribacterhongkongensis、Clostridiumhathewayi、Borreliaspielmaniih等。在这215个新种中，分枝杆菌属最多，达12种，诺卡菌属第2，有6种。从来源看，口腔及牙齿相关标本、胃肠道标本中发现的新种较多。Schlaberg等[21]对自2006～2010年临床分离的26 000多株细菌的16S rDNA序列进行分析，发现与现有公开数据库序列同源性<99%的有673株，表明存在新的种，其中同源性<95%的有111株，表明存在新的属。在患者标本中发现95个新分类单位(novel taxa)，共计348株分离株。其中最多的是诺卡菌属，共有42株分离株，14个新种；其次是放线菌属，有52株分离株，12个新种。分离株16S rDNA测序分析有助于研究这些新菌种与临床疾病的关联性。

最新版的《伯杰氏细菌系统分类学手册》就参考16S rDNA序列，不再是依据表型，而是以系统进化框架为基础进行细菌分类和命名。由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)于2007年领衔启动的人体微生物组项目(Human Microbiome Project，HMP)研究中，16S rDNA测序是常用手段之一，通过对志愿者口腔、鼻腔、消化道、皮肤和泌尿生殖道等不同部位的微生物群落进行分析，课题组已公布了从242名成年志愿者中获得的5 177份16S rDNA序列[22]。16S rDNA测序作为细菌分类的一种系统方法，在HMP计划中发挥着重要作用。

3.5 The MicroSeq 500 16S rDNA细菌鉴定系统

美国Applied Biosystems公司开发的The MicroSeq 500 16S rDNA细菌鉴定系统，基于扩增细菌16S rDNA 5′端的527 bp片段，其引物设计针对所有细菌，是一种通用的细菌鉴定系统。标本中细菌16S rDNA经扩增、测序后，与该系统自带的数据库比对，可实现对分枝杆菌属、棒状杆菌属及诺卡菌属等细菌的快速鉴定[13,23]。Cloud等[24]通过对119株分枝杆菌的研究发现，该法与传统的表型鉴定结果符合率达87%，适合于鉴定生长非常缓慢的分枝杆菌。有研究表明，该系统对临床分离株鉴定至属和种的准确率可达86.5%和81.1%，对生化检测无法确定的细菌其鉴定能力甚至强于实验室常用的3种全自动细菌鉴定仪[23]——Vitek、RapID和API。但该系统对厌氧革兰阳性杆菌鉴定至属和种的准确率稍低，分别为80%和65%，表明其厌氧菌数据库有待不断扩充[25]。Fontana等研究发现，对于用Phoenix或Vitek全自动细菌鉴定仪不能鉴定的一些细菌，该系统也能正确鉴定，显示其在分离株鉴定中可发挥重要作用[26]。

4 临床细菌鉴定中存在的挑战和困难

4.1 引物设计及扩增假阳性问题

尽管细菌16S rDNA存在多个保守区，但没有针对哪个保守区序列设计的PCR引物适合于扩增所有细菌。细菌、衣原体、螺旋体、立克次体等不同种类微生物之间16S rDNA保守区虽然存在共有序列(consensus sequence)，但各种类间仍存在若干碱基不同。扩增细菌16S rDNA的“通用引物”也是相对的，通常是在共有序列的基础上设计一套PCR引物[4]。因此，针对被检微生物的种类不同或临床标本不同，应选择相对应的通用引物，才能达到特异扩增效果。如果引物设计不当，还可出现与人基因组的交叉反应，导致PCR结果错误判读[27]。由于PCR本身的高敏感度，极微量污染也可能出现假阳性。污染可发生在标本采集、核酸提取乃至PCR操作各环节，尤其是在标本(脑脊液，胸、腹腔积液，心瓣膜或活检标本等)采集环节中最易发生。如采取关节炎患者关节腔滑液标本时，应避免皮肤表面细菌污染。在使用通用引物进行16S rDNA扩增时，污染细菌会导致假阳性出现。因此，在PCR扩增及其测序的各环节都必须建立并遵循标准化操作规程(standard operating procedure，SOP)[2,20]。美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2008年发布的CLSI指南首次增加了专门针对细菌DNA扩增及测序的操作规范及判断标准。

4.2 分离株测序鉴定的筛选问题

细菌16S rDNA测序鉴定需进行DNA扩增、测序和分析，其设备条件和实验成本比传统的表型鉴定更高，且不能对所有细菌都鉴定至种的水平，这是目前一般临床实验室尚未普及该项目的原因之一[28]。为评价哪些细菌的确需进行16S rDNA测序鉴定，Mahlen等[29]设计了一套严谨的筛选策略，如形态学与生化检测结果不一致或十分奇怪的分离株、与疾病的相关性或解剖位置不相符的分离株、在浅层伤口或呼吸道标本存在炎性细胞时分离出的优势菌株、尿道标本中分离出的菌量达104～105CFU/ml的菌株、正常时无菌体液中分离出的量很多的菌株等，只对这些分离株进行16S rDNA测序鉴定。就革兰阴性杆菌和球菌而言，实际需进行16S rDNA测序鉴定的只占其总种类的1.6%。采用一般表型鉴定方法能正确鉴定的绝大多数分离株不需DNA测序，以符合临床细菌鉴定的低成本、省时、高效的要求。

4.3 比对数据库

目前用于细菌16S rDNA序列检索和比对的软件包及其数据库主要有以下几个。① RDP-Ⅱ：1991年由美国密西根州立大学建立，可下载免费使用。其序列来自GenBank公共数据库，序列数量庞大，其中部分序列无从考证其准确性，导致部分序列品质不高[1]。截止2012年12月，注册的各类16S rDNA达2 639 157条。② MicroSeq ID：1998年由美国Applied Biosystems公司研发，作为有偿使用软件，其与The MicroSeq 500 16S rDNA细菌鉴定系统配套，包括16S rDNA 5′端527 bp序列和16S rDNA全长序列2个数据库。其序列源自每种细菌的一个纯培养菌株的测序结果，可靠性高是其最大优势。最新的527 bp数据库包含2 020个序列，16S rDNA全长数据库有1 262个序列。③ RIDOM：1999年由德国Ridom GmbH公司开发，包括奈瑟菌科(Neisseriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)及分枝杆菌属等细菌的16S rDNA序列。其序列来自每一种细菌的16S rDNA测序结果，可免费提供240种细菌的16S rDNA比对。④ SmartGene IDNS：2006年由瑞士SmartGene GmbH公司研发，有偿使用。其序列来源于GenBank，也存在部分序列可靠性不高的问题。因此，标本中细菌16S rDNA扩增、测序后，要选择合适的数据库来进行比对分析[30]。

5 结语

从鉴定的准确率来看，建立在细菌分离株基础上的16S rDNA扩增及测序具有的优势毋庸置疑，因此被视为细菌鉴定与分类的“金标准”。如前文所述，国内外实验室对一些血培养标本、抗生素治疗后标本的研究已证实这一点。但真正应用于临床实验室标本的直接检测还存在诸多问题，如标本污染如何克服、通用引物如何选择、测序结果如何准确判读等。目前临床标本的细菌鉴定还主要依靠形态学、分离培养和生化检测等常规方法及Vitek、RapID和API等全自动细菌鉴定系统，而细菌16S rDNA扩增及测序鉴定方法作为一种辅助手段，适合在一些常规方法难以鉴定的细菌、罕见的细菌、难以培养的细菌、全自动细菌鉴定仪数据库中没有描述的细菌及新的细菌种类分析等情况下使用。

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