均匀试验设计优化酶法提取燕麦全粉蛋白质研究

刘建垒 李英杰 郝利平

(山西农业大学食品科学与工程学院，太谷 030801)

燕麦，学名Avena sativaL.，又被称为莜麦、雀麦、玉麦、铃铛麦。燕麦被称为“第三主粮”，现代研究表明燕麦具有降血脂、降血糖、免疫增强、抗氧化、益生等多种保健功能[1－2]，是美国《时代》专刊推荐现代人十大最健康的食品之一。

燕麦中蛋白质含量高达15%，在禾谷类粮食中居首位[3]，且同时具备人体8种必需氨基酸，其配比接近FAO/WHO推荐的模式；限制性氨基酸赖氨酸和色氨酸含量高[4－5]；燕麦蛋白质净利用率(NPU)达69.1～72.4；功效比(PER)达2.25～2.38；氨基酸分数(AAS)高达68.2，生物价(BV)为 74.5～79.6，均是植物蛋白中的佼佼者[6－8]。

以往研究报道主要以燕麦麸为原料[3，9]，对燕麦全粉的研究较少，且多数用碱提酸沉法[10－11]，而酶法提取燕麦全粉蛋白的研究鲜见报道。与碱提酸沉法相比，酶法具有提取率高，反应条件温和，易于控制等优点，且产品的营养价值及生物功能较优[12]。本研究选用产量高、抗旱性好，适应性强的燕麦新品种晋燕14号为研究对象，用均匀试验设计对酶法提取燕麦蛋白的工艺进行优化，以期为燕麦全粉中蛋白质的提取和利用提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕麦:晋燕14号，山西省农业科学院高寒区作物研究所(脱脂燕麦全粉中蛋白质含量15.6%)。

碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶:北京奥博星生物技术有限责任公司；中分子质量蛋白Marker:北京康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

KDN型定氮仪(HYP8.14.20孔消化装置、2C型蒸馏装置):上海钎检仪器有限公司；JY－15A 750克多功能粉碎机:永康市江业制造有限公司；UV－2100型紫外可见分光光度计:尤尼柯(上海)仪器有限公司；pHS－25型数显pH计:上海精密科学仪器有限公司；JDG－0.2真空冻干试验机:兰州科近真空冻干技术有限公司；SHY－2A水浴恒温振荡器:江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；DYCZ－24D型电泳槽、DYY－6C型电泳仪:北京市六一仪器厂；Image LabTM4.0.1全自动图像获取和分析软件，Molecular Imager Gel DocTMXR＋成像系统:美国Bio－Rad Laboratories公司等。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

脱脂燕麦全粉的制备:将新鲜燕麦清理后用JY－15A型多功能粉碎机粉碎30 s，用正己烷按1∶3(m/V)比例室温下振荡脱脂3 h，过滤，并用冷的正己烷冲洗3次，冲洗后置于通风橱中风干，4℃保存备用。

工艺流程:脱脂燕麦全粉→酶法提取→灭酶→离心→上清液等电点沉淀→离心→沉淀物→水洗至中性→真空冷冻干燥→燕麦蛋白。

1.3.2 酶制剂的筛选

试验所用蛋白酶及其反应条件如表1所示。以0、20、40、60、80、100、120、140 U/g分别加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶，液料比15∶1，调至各蛋白酶的适宜条件，恒温水浴震荡反应60 min，85℃灭酶 10 min，4 000 r/min离心 15 min，测上清液中蛋白含量，计算蛋白提取率。

表1 试验所用蛋白酶的活性及反应条件

1.3.3 均匀设计优化酶法提取燕麦蛋白的工艺参数

根据单因素试验结果选择试验条件，对加酶量、液料比、pH、浸提温度、浸提时间进行五因素十水平U10(1010)均匀设计[13]，因素水平表见表 2，以蛋白提取率为评价指标，确定酶法制备燕麦蛋白的最佳工艺条件。

表2 U10(1010)均匀试验因素水平表

1.3.4 燕麦蛋白等电点的确定

在得到的最佳提取条件下提取燕麦蛋白，取11等份蛋白提取上清液，分别用0.2 mol/L HCl缓慢调其 pH至 3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8，静置6 h，4 000 r/min离心15 min，测定沉淀前后上清液中蛋白质的含量，计算蛋白分离率。

1.3.5 测定与计算方法

固体中蛋白质含量测定:凯氏定氮法，参照GB 5009.5—2010。

溶液中蛋白质含量测定:Bradford法[14]，其标准曲线见图1。

图1 Bradford法测定蛋白含量标准曲线

蛋白质提取率＝(提取液中蛋白质的含量－添加酶中蛋白质的含量)/(燕麦粉中蛋白质的含量)×100%

产品纯度＝固形物中总蛋白的质量/总固形物质量×100%

蛋白分离率＝(沉淀前上清液中蛋白含量－沉淀后上清液中蛋白含量)/(沉淀前上清液中蛋白含量)×100%

1.3.6 燕麦蛋白的SDS－PAGE电泳分析

采用5%浓缩胶、15%分离胶对得到的燕麦蛋白质进行SDS－PAGE电泳分析。凝胶厚度1.5 mm，燕麦蛋白上样15μL(预先标准化为1 mg/mL)。稳压电泳，初始电压80 V，样品进入分离胶后改为100 V，电泳3.5 h。用考马斯亮蓝R－250染色1 h，用脱色液(乙醇∶乙酸∶蒸馏水 ＝5∶2∶13)脱色 12 h。用图像获取和分析软件拍照并进行分子质量分析。

1.4 数据处理

每个试验重复3次，以估计试验误差。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对提取率的影响

从表3可以看出，3种蛋白酶对燕麦蛋白提取率的影响大小依次为碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶，且中性蛋白酶和酸性蛋白酶的提取率远低于碱性蛋白酶，这是由于中性和酸性条件下，蛋白质溶解度低造成的。

当碱性蛋白酶的用量小于100 U/g时，燕麦蛋白提取率随着加酶量的增加而增加，可能是由于加酶量的增加提高了酶对不溶性蛋白的作用能力，促进了燕麦蛋白的溶出[15]。当加酶量超过100 U/g时，随着加酶量的增加燕麦蛋白的提取率降低，可能是由于过多的酶将蛋白质过度水解，空间结构发生改变，疏水性基团暴露出来，使蛋白质溶解度下降。因此，选定碱性蛋白酶为提取酶类，在加酶量为100 U/g条件下进一步研究其他因素对燕麦蛋白提取的影响。

2.2 酶法提取燕麦蛋白单因素试验结果

2.2.1 液料比对蛋白质提取率的影响

从图2可以看出，蛋白提取率随液料比的增加而升高，当液料比达18∶1时，提取率最高，可达79.71%；当液料比超过18∶1后，提取率略有降低。这是由于液料比较小时，体系黏度较大，不利于传质；但液料比过大，酶与底物的接触几率下降，使蛋白质的提取率降低[16]。

图2 液料比对蛋白质提取率的影响

2.2.2 pH对蛋白质提取率的影响

从图3可以看出，燕麦蛋白的提取率随pH的增大而提高，当pH值为11时，燕麦蛋白的提取率最大，达79.90%，之后随着pH的增加，提取率变化不大。pH超过11时，燕麦蛋白提取液呈黄褐色，有异味，且变得黏稠，不利于下一步的分离。这可能是因为过高的pH使蛋白质－蛋白质之间的相互作用加强造成溶液黏度增加[17]，蛋白质发生了变性。

图3 pH值对蛋白质提取率的影响

2.2.3 浸提温度对蛋白质提取率的影响

从图4可以看出，40℃至50℃时，燕麦蛋白的提取率随温度的升高而增大，从50℃至55℃，提取率变化不大，仅由79.70%升高到79.99%，之后随着温度的升高，提取率反而降低。一方面，温度过高时，由于热动能的增加导致蛋白质结构展开、非极性基团暴露、聚集和沉淀作用[17]，使蛋白的溶解度降低和酶活力减弱；另一方面，温度过高使淀粉糊化，不利于蛋白的溶出，反应速度迅速下降。

图4 浸提温度对蛋白质提取率的影响

2.2.4 浸提时间对蛋白质提取率的影响

从图5可以看出，20～60 min内，蛋白质的提取率随着时间的延长迅速增大，其原因可能为开始时底物浓度相对较高，且淀粉的结构随着时间的延长而越来越松散，从而有利于酶解的传质过程。60 min时提取率达最大值，为79.87%；60 min后，随时间的进一步延长，提取率反而略有下降，原因可能是酶作用时间的延长，使蛋白质过度水解，空间结构发生改变，疏水性基团暴露出来，造成溶解度降低的缘故。

图5 浸提时间对蛋白质提取率的影响

2.3 均匀设计优化酶法制备燕麦蛋白的工艺参数

在以上单因素试验基础上，选定均匀试验设计的条件，确定因素水平表(表4)。表4显示了均匀设计方案与结果，用直观分析法可以看出，试验5的提取率最高，达83.41%，即加酶量90 U/g，pH 11.2，温度52℃，液料比17∶1，时间45 min。但由于 pH过高，得到的燕麦蛋白提取液颜色加深，呈黄褐色，有异味，且变得黏稠，不利于下一步的分离。为得到更优的结果，进一步用SAS8.1对试验结果进行逐步回归分析，建立逐步回归的多项式模型。

得到回归方程:Y＝2．339X1＋4．864X2＋28．019X3＋0．596X4－0．012 8X12－0．262X32＋0．012 4X1X4－0．001 6X4X5－854.672，校正后的决定系数 R2＝0.998 7。

表4 U10(1010)均匀设计方案与结果(D＝0.428 6)

进一步对回归关系及各偏回归系数进行显著性检验。对回归关系进行方差分析(表5)可知，由于F0.01(8，1)＝5 982，F0.05(8，1)＝238.9，故 F0.01(8，1)＞F＞F0.05(8，1)，0.05＞P＞0.01，回归关系显著。

表5 回归关系的方差法分析

对各偏回归系数进行t检验(表6)，结果表明:X1(加酶量)、X2(pH)、X3(温度)对燕麦蛋白提取率的影响达显著水平，X4(液料比)和X5(时间)影响不显著。根据t检验的显著程度及偏回归平方和的大小可判断，各因素对指标影响的主次顺序为温度＞加酶量＞pH＞液料比＞时间。

表6 对常数项及偏回归系数的t检验

用规划求解参数法[13]在试验空间内找到极值点X1＝100．358，X2＝10．5，X3＝53．493，X4＝18，X5＝60，即加酶量 100.358 U/g，pH 10.5，温度 53.49℃，液料比18∶1，时间60 min，在此条件下，理论提取率为83.31%。验证试验得燕麦蛋白的提取率为84.09%，与理论提取率仅差0.78%。进一步用凯氏定氮法测得燕麦蛋白纯度达89.16%，说明在此条件下提取的燕麦蛋白提取率和纯度都较高。

2.4 燕麦蛋白等电点的确定

等电点沉淀是为了确保提取液中的蛋白质能最大程度的沉淀下来。图6所示为不同pH条件下提取液中的蛋白质的沉淀效果。从图6中可以看出，在pH 4.4时，燕麦蛋白的分离率最大，达93.33%，故燕麦蛋白的等电点为4.4。

图6 燕麦蛋白等电点的确定

2.5 燕麦蛋白SDS－PAGE电泳分析

由燕麦蛋白的SDS－PAGE图谱(图7)可以看出，酶法制备的燕麦蛋白在65.2～12.5 ku上都有条带分布，且主要集中在31.3～40.0 ku(条带百分比占39.86%)，21.0～21.9 ku(条带百分比占34.45%)2个区间，其中含量超过10%的条带有3条，分别为:21.0 ku(条带百分比占26.88%)，38.3 ku(条带百分比占16.32%)，40.0 ku(条带百分比占12.60%)，与管骁等[18]的研究结果基本一致。此外，与碱法相比，酶法制备燕麦蛋白的 58.6、53.0、42.5、29.3、28.0、25.7 ku条带缺失，可能是因为酶将其水解的缘故。

图7 燕麦蛋白的SDS－PAGE图谱

3 结论

3.1 3种蛋白酶对燕麦蛋白提取率的影响大小依次为碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞酸性蛋白酶，选定碱性蛋白酶为提取酶类。

3.2 碱性的蛋白酶提取燕麦蛋白的最佳工艺为:加酶量100.358 U/g，pH 10.5，温度53.49℃，液料比18∶1，时间 60 min，在此条件下，提取率为84.09%，纯度达89.16%，得到的燕麦蛋白的等电点为4.4。

3.3 酶法制备燕麦蛋白在65.2～12.5 ku上都有条带分布，其中74.3%的条带集中在31.3～40.0 ku和21.0～21.9 ku2个区间，与碱法相比，有条带缺失。

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