硝苯地平对氯化钾、去甲肾上腺素及内皮素诱导离体大鼠血管收缩的影响

杜 珍，谢学渊，张 沂

硝苯地平(nifedipine)属于电压依赖性钙通道拮抗剂类抗高血压药物。KCl、去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、内皮素(endothelins，ET-1)均可诱导血管收缩，也是制备离体高血压模型的常用药物，但其作用机制有所不同。KCl溶液可诱导细胞膜电位去极化，使细胞膜电压依赖性钙通道激活，引起细胞外钙内流从而诱发血管收缩;NE可激动血管平滑肌上的α1受体，引起强大的血管收缩作用;ET-1是一种由21个氨基酸组成的多肽，是迄今为止作用最强和持续最久的缩血管物质，其作用机制尚不清楚。本研究观察硝苯地平对KCl、NE、ET-1诱导离体大鼠胸主动脉血管收缩的影响，以对硝苯地平的作用机制进行深入的探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物和药剂:Wistar大鼠，体质量200～250 g，雄性，由中国医学科学院提供，合格证号SCSK11-00-0006。硝苯地平为石家庄新华制药厂生产，纯度98%;NE由上海禾丰制药有限公司生产;ET-1由美国Sigma公司生产;其余试剂均为分析纯。(2)仪器:MedLab-U/4CS生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司);肌肉张力换能器(高碑店市新航机电设备有限公司);超级恒温器(上海市实验仪器厂)。(3)Krebs-Henseleit营养液(K-H液):组成如下:无水 CaCl22.52 mmol/L，KH2PO41.18 mmol/L，KCl 4.69 mmol/L，NaCl 118.07 mmol/L，NaHCO325.00 mmol/L，MgSO4·7H2O1.18 mmol/L，Glucose 10 mmol/L。pH 7.4。无钙营养液组分中以EGTA 50 μmol/L取代CaCl2。

1.2 方法 大鼠离体胸主动脉环按文献［1］方法制备。大鼠处死后迅速打开胸腔，取出胸主动脉，置于4℃ K-H液中，通以95%O2+5%CO2气体，清洗血液，除去血管壁的脂肪与结缔组织，剪成3～4 mm长的血管环。主动脉环通过换能器与生物信号采集处理系统相连，浴槽容积为10 ml，恒温37℃，持续通入95%O2+5%CO2气体，静止张力1 g，每15 min换1次新鲜的营养液，平衡至少1 h且主动脉环稳定后进行实验。分别加入 20 mmol/L KCl、10 μmol/L NE、1 mmol/L ET-1预收缩主动脉环，待达到最大幅度后，按累积法向浴槽内加入硝苯地平溶液，同时以等量溶剂作为阴性对照，观察硝苯地平的扩血管作用。

1.3 统计学处理 以主动脉环最大收缩幅度为100%，计算硝苯地平的扩血管幅度。用graphpad prism 5软件作图并统计，计算硝苯地平扩血管作用的半数有效剂量EC50、EC50的95%可信区间、Hillslope值及曲线的r值。

2 结果

2.1 硝苯地平对KCl诱导离体大鼠主动脉环收缩的影响 麦氏浴槽内含钙营养液KCl浓度为20 mmol/L时，血管迅速收缩，此条件下硝苯地平扩血管的 EC50值为 0.072 μmol/L，EC50的 95%可信区间0.051 ～ 0.101 μmol/L，Hillslope 值为 1.1，r值为0.9651。见图1。在无钙营养液中，硝苯地平无对抗KCl诱导离体大鼠主动脉环收缩的作用。

图1 硝苯地平对KCl诱导离体大鼠主动脉环收缩的作用

2.2 硝苯地平对NE诱导离体大鼠主动脉环收缩的影响 大鼠离体主动脉环在含钙营养液NE 10 μmol/L预收缩后加入不同浓度的硝苯地平，观察硝苯地平的扩血管作用。结果显示，硝苯地平扩血管的 EC50值为 5.34 μmol/L，EC50的 95% 可信区间 3.11 ～9.18 μmol/L，Hillslope值为 1.1，r值为0.9378(图2)。在无钙营养液中，硝苯地平(0.01 ～10 μmmol/L)无明显对抗 NE 收缩血管的作用。

图2 硝苯地平对NE诱导离体大鼠主动脉环收缩的作用

2.3 硝苯地平对ET-1诱导离体大鼠主动脉环收缩的影响 在含钙的营养液中，硝苯地平0.01～10 μmol/L呈浓度依赖地对抗ET-1诱导的离体大鼠主动脉环收缩，其 EC50为 0.15 μmol/L，EC50的 95% 可信区间 0.12 ～ 0.19 μmol/L，Hillslope 值为 0.46，r值为0.9780。见图3。在无钙营养液中，高浓度硝苯地平(10 μmol/L)无对抗ET-1诱导的离体大鼠主动脉环收缩的作用。

图3 硝苯地平对内皮素诱导离体大鼠主动脉环收缩的作用

3 讨论

高钾溶液可诱导细胞膜电位去极化，使细胞膜电压依赖性钙通道激活，引起胞外钙内流从而诱发血管收缩。由于硝苯地平对电压依赖性钙通道具有强效高选择性阻断作用，所以具有明显的抗KCl缩血管作用。同时由于NE的缩血管作用与促进细胞内钙释放和诱导细胞外钙内流有关，因此在含钙的营养液中，硝苯地平具有轻微的扩血管作用;而在无钙营养液中，硝苯地平无明显对抗NE收缩血管的作用。

同硝苯地平对KCl诱导离体大鼠主动脉环收缩的影响实验结果相比，硝苯地平之所以具有强效的抗KCl缩血管作用，与其对电压依赖性钙通道具有强效高选择性阻断作用密不可分。

以往的实验结果表明，在含钙的营养液中，NE的缩血管效应既与其促进细胞内钙释放有关，也与其诱导细胞外钙内流有关。因此，笔者进一步在无钙营养液中观察硝苯地平对NE缩血管效应的影响。结果显示，在无钙营养液中，NE 0.6 μmol/L迅速诱发血管收缩，此与促进细胞内钙释放有关。硝苯地平0.01～10 μmol/L无明显对抗NE收缩血管的作用，表明硝苯地平无对抗细胞内钙离子释放诱发血管收缩的作用。

硝苯地平具有抑制钙内流的作用，而对细胞内钙释放没有明显的影响。高剂量硝苯地平仍不能完全对抗ET-1诱导的离体主动脉收缩，可能与其对ET-1诱导的细胞内钙动员没有明显的影响有关。

Liu 等［2］和 Nakajima 等［3］的研究结果表明，ET-1诱发血管平滑肌收缩的作用与NE相似，涉及细胞内钙释放和促进细胞外钙离子内流两种机制。当ET-1与其受体结合后，通过G蛋白，激活磷脂酶C，使4，5-二磷酸肌醇磷酯分解为三磷酸肌醇和二脂酰甘油。三磷酸肌醇作用于滑面内质网和肌浆网，使细胞内钙库中钙离子释放入胞浆，增加细胞内游离钙浓度。二脂酰甘油可激活蛋白激酶C，促进细胞靶蛋白质的磷酸化，提高细胞反应性。此外，三磷酸肌醇在特异性酶作用下，可促进细胞膜上电压依赖性钙离子通道开放，使细胞外钙离子内流，从而补充细胞内钙离子贮库并激发血管收缩。在无钙离子介质中ET-1主要通过受体后的细胞内信息传递系统动员内钙离子释放，引起血管收缩，而在含钙基质中，ET-1还可促进细胞外钙离子内流，故其缩血管作用涉及促进外钙内流和动员内钙释放两种机制。所以，同NE相似，硝苯地平在在含钙的营养液中能明显的对抗ET-1的缩血管作用;而在无钙营养液中没有明显的扩血管作用。以上结果提示，电压依赖性钙通道拮抗剂硝苯地平对内钙释放诱发的血管收缩无明显对抗作用，此结果与文献报道一致［4-5］。

［1］ 付彦军，尤春来，张效禹，等.去青紫堇碱对大鼠离体胸主动脉平滑肌的作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2001，15(5):326.

［2］ Liu YA，Ostlund E，Fried G.Endothelin-induced contractions in human placental blood vessels are enhanced in intrauterine growth retardation，and modulated by agents that regulate levels of intracellular calcium［J］.Acta Physiol Scand，1995，155(4):405-414.

［3］ Nakajima T，Hazama H，Hamada E et al.Endothelin-1 and vasopressin activate Ca2+-permeable non-selective cation channels in aortic smooth muscle cells:mechanism of receptor-mediated Ca2+influx［J］.J Mol Cell Cardiol，1996，28(4):707-722.

［4］ 汪海，史大军，路新强，等.新型钙通道拮抗剂尼卡地平衍生物的心血管效应［J］.军事医学科学院院刊，1997，21(1):5-9.

［5］ 何华美，汪海，肖文斌.吡那地尔和硝苯地平对内皮素缩血管作用的影响［J］.中国药理学通报，1997，13(6):502-505.