改良的大鼠心肌微血管内皮细胞培养方法

王志华 张普 朱伟 张庆勇，＊

心肌微血管结构和功能变化在心血管疾病如冠心病、高血压和糖尿病心肌病病变过程中发挥着重要作用［1，2］。心肌微血管的新生是心肌细胞种植、心肌重塑成功与否的关键，因此，建立有效的心肌微血管内皮细胞（MMVECs）体外培养体系能为进一步深入研究心血管相关疾病的发病机理及治疗提供重要的细胞模型。由于心肌微血管段分离步骤复杂，所用培养方法如灌注法、酶消化法等存在一些问题，使获得的内皮细胞量较少，纯度也不高。故目前的相关体外研究多采用容易得到的大血管内皮细胞，如人脐静脉内皮细胞或主动脉内皮细胞等。但是，血管内皮细胞具有明显的器官特异性和组织特异性［3］，利用大血管内皮细胞研究的结果很难客观、准确地解释MVECs病变［4］。本研究以文献报道的贴块法为基础［5，6］，通过心肌组织贴块法和培养液中加用肝素的方法建立了简单、快速、可靠，且可获得高纯度MMVECs的体外培养体系。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

倒置显微镜、倒置分光荧光显微镜及显微摄像系统（Leica，德国）、CO2细胞培养箱（Heraeus，德国）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.2 动物和试剂

选用6～8周龄Wistar雄性大鼠（约60～100g）（上海斯莱克实验动物中心）。DMEM 高糖培养基（Invitrogen，美国）；鼠尾胶（自制）；胰蛋白酶（1∶250，Ameresco，美国）；胎牛血清（FBS，Gibco，美国）；兔抗鼠CD34单克隆抗体、兔抗鼠CD31单克隆抗体（Antibody Diagnostica Inc，美国）；兔抗人VIII因子相关抗原多克隆抗体（DAKO，丹麦）；抗兔及抗鼠ABC 试剂盒、DAB 显色试剂盒、FITC 标记羊抗兔IgG（Beyotime，中国）；其余化学试剂为国产分析纯商品。

1.3 实验用肝素的配制

市售肝素钠注射液（12500U，1ml／安瓿，批号：H32020612，万邦医药，江苏）加入24ml生理盐水中，用0.22μm 针头滤器抽滤，即成500U／ml的母液。使用前加入适量20%FBS DMEM 高糖培养液中，使培养液中肝素浓度为20U／ml。

1.4 植块法培养大鼠MMVECs

Wistar大鼠3～5只，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，再腹腔内注射200U 肝素。将大鼠于75%乙醇浸泡消毒30min后移至超净工作台进行操作：逐层打开胸腔，暴露心脏，剪开心包，由升主动脉处剪下心脏，放入PBS缓冲液中，将心腔中的血液冲洗干净，辨清心脏解剖结构，去除大血管、左右心房以及右心室和室间隔，保留左心室，小心去除心内膜及心外膜，用眼科剪将心室肌剪成若干大小约2mm3小块，均匀接种于鼠尾胶预处理过的培养皿中，组织块间隔1～3mm，滴加少许FBS，置37℃、5%CO2细胞孵育箱静置培养，使其贴壁；约40min后加入5ml含20%FBS DMEM 高糖培养液；约48h后用倒置显微镜观察，若组织块周围有细胞长出，则更换一半上述培养液，约70h去除组织块，继续培养36h。待细胞生长至铺满皿底80%～90%后，用含0.125%胰蛋白酶消化细胞进行传代。选取第二代细胞进行鉴定。

1.5 MMVECs鉴定

采用免疫组织化学和免疫荧光染色法对MMVECs进行鉴定。CD31和CD34分别参照抗兔及抗鼠ABC试剂盒说明书操作，细胞和细胞核染成棕褐色为阳性；VIII因子抗体采用FITC标记，胞浆呈红色荧光；实验中用PBS作阴性对照。抗体稀释比例：CD34、CD31为1∶500，VIII因子为1∶200。

2 结果

2.1 培养MMVECs形态学观察

采用心肌组织块贴壁培养约48h 可见到MMVECs从组织块周围爬出，约70h 可见到组织块周围MMVECs明显增多，组织块之间内皮细胞可连接成片。去除组织块后约36h，MMVECs可以生长融合至80%～90%，呈典型铺路石样形态。见图1。

2.2 培养MMVECs鉴定

CD31染色显示所有MMVECs均染成棕褐色，细胞轮廓清晰。CD34染色显示细胞核染成棕褐色，以核周胞浆最为明显。VIII因子相关抗原染色显示胞浆呈红色荧光，以核周胞浆最明显。用PBS代替一抗染色的细胞未见特异性显色，为阴性反应。证实培养的MMVECs纯度很高。见图2。

［本文图1、图2见封4］

3 讨论

目前分离培养MVECs以酶消化法常用，因为该方法获得的内皮细胞生长快，数量多，纯度高。但是酶消化法也存在一些缺点：（1）消化酶价格较贵。（2）在消化过程中如何掌握酶的浓度和消化时间难度较大。酶浓度过高或消化时间过长，细胞从血管段脱落后被消化破坏而死亡，没有被消化破坏的细胞贴壁差，生长慢；而酶浓度过低或消化时间过短，则分离效果差，获得的MVECs数量少。本研究采用改良贴块法培养MVECs，主要创新在于：（1）腹腔内注射肝素使贴块后游出的血细胞不发生凝固而堵塞微血管，以利MVECs生长。笔者预实验时发现，在贴块培养过程中，血细胞首先游出，过多游出的血细胞既妨碍MVECs生长，又容易阻塞微血管，也妨碍MVECs 游出；腹腔内注射肝素还有利于PBS对组织块的彻底清洗，清除血细胞的影响。（2）培养液中加入肝素可促进MVECs生长及提高其纯度。应用贴块法获得更多MVECs的方法通常是延长去组织块的时间，这样就会存在成纤维细胞生长影响MVECs纯度的风险。通过在培养液中加入适量肝素，缩短去组织块时间，可显著提高MVECs的纯度，这与肝素本身可能有促进MVECs生长，以及细胞培养过程中产生多种生长因子与肝素结合而共同促进MVECs生长［7］有关。

MVECs一般呈单层生长，呈多边形或梭形，有接触抑制现象，细胞密度较高时呈铺路石样生长，电镜下可以看到Weibel-Palade小体。CD31和VIII因子相关抗原是内皮细胞的标志物，尤其后者为内皮细胞所特有，MVECs除了表达VIII因子和CD31外，还可表达MVECs的特异性分子标志CD34［4］。本研究从心肌组织培养的MVECs表现出典型的单层鹅卵石样排列［5］；通过免疫组化和免疫荧光染色表明，MMVECs 能明显表达VIII因子、CD31和CD34［8、9］，证明通过改良贴块法所获得的细胞确实是MVECs，而且纯度很高。

1 Tang WH，Maros A，Young JB.Ischemic heart disease and congestive heart failure in diabetic patients［J］.Med Clin North Am，2004，88（4）：1037～1061.

2 Clarke M，Dodson PM.PKC inhibition and diabetic microvascular Complications［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2007，21（4）：573～586.

3 Murthi P，So M，Gude NM，et al.Homeobox genes are differentially expressed in macrovascular human umbilical vein endothelial cells and microvascular placental endothelial cells［J］.Placenta，2007，28（2）：219～223.

4 宁艳霞，王新红，金惠铭，等.用基因芯片研究培养的大鼠心肌微血管内皮细胞特征［J］.中国病理生理杂志，2005，22（12）：2295～2300.

5 柳爱华，杨向红，王延林，等.大鼠心脏微血管内皮细胞的培养［J］.中国医科大学学报，2009，38（1）：55～56.

6 张涛，滕可导，田启超，等.乳鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养［J］.解剖学报，2008，39（1）：121～123.

7 曹喜才，范志斌，宋晓娜，等.碱性成纤维细胞生长因子联合肝素治疗下肢缺血的实验研究［J］.临床放射学杂志，2008，27（11）：1574～1578.

8 Clement CM，Thomas LK，Mou Y，et al.Neuregulin-1attenuates neointimal formation following vascular injury and inhibits the proliferation of vascular smooth muscle cells［J］.J Vasc Res，2007，44（4）：303～312.

9 Lemmens K，Segers VF，Demolder M，et al.Role of neuregulin-1／ErbB2signaling in endothelium-cardiomyocyte cross-talk［J］.J Biol Chem，2006，281（28）：19469～19477.