60Co-γ射线辐照对结缕草愈伤组织分化的影响

李三要，朱晓花，李科勇，刘海洋，汤佩芬

(1.湖南省邵阳市草地监理站，湖南 邵阳 422000； 2.邵阳职业技术学院，湖南 邵阳 422000)

诱变和组织培养相结合，对扩大遗传变异、加速育种进程、提高育种效率和改进育种技术具有重要意义，所以辐射诱变组织培养复合育种技术近年来成为研究热点[1-8]。结缕草是重要的草坪草，青岛结缕草(Zoysiajaponicacv.Qingdao)、兰引3号结缕草(Z.japonicacv.Lanyin 3)和马尼拉结缕草(Z.matrella)是目前国内结缕草资源开发利用中颇具代表性的结缕草品种。王文恩等[9]进行了日本结缕草(Z.japonica)成熟胚的愈伤组织诱导，郭爱桂等[10]以狗牙根(Cynodondactylon)为材料，研究了辐照对其的影响。以传统育种为基础，后用新发展的生物技术，可以培育出抗旱、抗寒、耐高温、耐盐碱、抗病、抗虫、耐践踏、竞争性强、耐阴、对污染物耐受性强、能稳定遗传的草坪草新品种、新品系。本研究将电离射线导入结缕草的愈伤组织诱导中，观测其对结缕草愈伤组织分化的影响，希望能提高其愈伤组织的胚性转化率，为建立这3个品(种)的高频再生体系打下基础。

1 材料与方法

1.1试验材料 以兰引3号结缕草(YJ)、马尼拉结缕草(BJ)和青岛结缕草(QJ)的茎基作为外植体材料，进行愈伤组织诱导及辐照诱变处理。

诱变处理源为60Co-γ射线，由江苏省扬州市农科所辐照中心提供。

1.2试验方法

1.2.1愈伤组织诱导 取供试结缕草的茎基，置于配方为MS+2,4-D(2 mg·L-1)+6-BA(0.1 mg·L-1)的愈伤组织诱导培养基上，每瓶放置10个，设5个重复，在(25±1)℃的条件下暗培养。

1.2.2辐照处理方法 将培养14 d的愈伤组织，进行60Co-γ射线诱变处理，剂量梯度设为0、5、10、15、20、25、30和40 Gy，每个剂量设3个重复。剂量率为1.0 Gy·min-1。

1.3继代培养 经过诱变处理后的愈伤组织30 d继代一次，统计愈伤组织死亡率、出愈率，并观察愈伤组织生长情况，80～85 d后统计胚性愈伤组织形成率。

1.4胚性愈伤组织筛选 将筛选出的胚性愈伤组织转入MS培养基中进行分化培养。

2 结果与分析

2.160Co-γ射线处理结缕草愈伤组织半致死剂量(LD50)的筛选 随着辐照剂量的增加，3个(品)种愈伤组织的死亡率呈上升趋势，当剂量大于25 Gy后，死亡率急剧升高，当剂量上升为30 Gy时，3个结缕草(品)种愈伤组织的死亡率均超过50%，故30 Gy为其半致死剂量，并将在后续试验中加以应用。当剂量继续升高至40 Gy后，愈伤组织死亡率均超过3/4，且剩下的愈伤组织均稍微发褐，故由结缕草QJ、YJ和BJ茎基诱导而出的愈伤组织，其辐射处理的适合剂量为1～30 Gy。3个(品)种之间比较而言，QJ在剂量为10、15、20 Gy时愈伤组织零死亡，与0 Gy无明显差异；而YJ和BJ的愈伤组织辐射处理后，愈伤组织的死亡率明显高于0 Gy，这可能是因为不同品种愈伤组织的辐射敏感度不同(表1)。

表1 不同剂量下青岛结缕草(QJ)、兰引3号结缕草(YJ)和马尼拉结缕草(BJ)愈伤组织死亡率比较Table 1 Comparison of callus death rate of QJ、YJ and BJ under different radiation doses

2.260Co-γ射线处理对出愈率及胚性愈伤组织形成率的影响 普遍认为，辐照诱变处理，中低剂量处理能提高出愈率和幼苗分化率；相反，高剂量降低出愈率和分化率。如在辐照的水稻(Oryzasativa)和小麦(Triticumsativum)的花药愈伤组织、成熟胚及幼穗中都观察到出愈率的提高[11]。本研究同样发现，低剂量时各(品)种的出愈率均高于0 Gy，说明小剂量辐照对愈伤组织生长具有刺激效应， 但这种刺激效应随时间的延长逐渐消失。剂量升高至25 Gy以后，愈伤组织出愈率急剧降低(图1)，远远低于0 Gy，但(品)种之间的差异不明显。胚性愈伤形成率方面，3个(品)种的胚性愈伤组织形成率随着剂量的升高总体上呈现了先升后降的趋势，20 Gy辐照处理时，QJ、YJ、 BJ愈伤组织的胚性形成率均达到峰值，分别为37.5%、76.5%和63.6%，分别较0 Gy高28.9%、60.8%和53.3%。在15 Gy剂量作用下，QJ、YJ和BJ也获得了较高的胚性愈伤组织形成率，分别为35.7%、65.0%和55.0%。当剂量升至25 Gy后，胚性愈伤形成率明显降低，但较之出愈率，降幅较小(图1)。可见，高剂量的辐射处理对出愈率的影响大于胚性愈伤组织形成率。

出愈率方面，5、10和20 Gy处理之间差异不明显，但与0 Gy相比略有不同，愈伤组织结构紧实、表面颗粒状略显干燥、白色绒毛的生成量大大减少，甚至没有(表2)。继代培养30～35 d后，个别愈伤块褐化死亡。而25、30、40 Gy处理则大不相同。在辐照3～5 d后愈伤组织表面明显干燥、灰暗，出现黄褐色，褐化程度随辐照剂量的增大而加重，30 Gy处理在继代培养25～30 d后愈伤组织严重褐化，各品种死亡率均超过50%，由此可知，此剂量为半致死剂量(LD50)。40 Gy处理在辐照后原培养基上培养第20-25天时大部分或全部都褐化死亡，死亡率超过70%。但经30、40 Gy处理后未褐化的愈伤组织，在其底部有黄色或黄绿色诱变细胞体产生，体积增大明显，上部原有愈伤组织呈黑褐色萎缩。

图1 辐照对结缕草出愈率及胚性愈伤形成率的影响Fig.1 Effects of radiation on callus rate and embryogenic callus rate of Zoysia spp.

表2 不同剂量下的愈伤组织的形态变化Table 2 Callus morphological characterization under different radiation dose

总体来说，YJ的颗粒状结构最为明显，其次为BJ，再次为QJ。在胚性愈伤诱导的后期，愈伤块完全转变为松散的绿色颗粒物的集合体，同时可以观察到白色或黄色突变体颗粒物的生成，颗粒可用镊子轻轻剥离整体，同时若将这种松散颗粒的集合体转入未添加任何外源激素的MS培养基中，则每一个绿色颗粒均可分化再生出一棵完整的结缕草再生植株。

3 讨论与小结

3.1基因型对结缕草出愈率及胚状体获得的影响 QJ、YJ和BJ属于不同的基因型，其遗传背景有很大差异，采用常规方法培养其营养器官及幼穗等，其愈伤组织形成、绿苗的分化和再生能力有很大差异。本试验所采用的QJ、YJ和BJ(品)种之间由于其基因型的不同，愈伤组织形成和绿苗分化再生能力也不同。QJ的茎基形成愈伤组织较容易，但产生绿苗极难，常规培养条件下绿苗分化率仅为9.09%，而YJ和BJ茎基的愈伤组织形成虽然难于QJ，但其绿苗再生较QJ要容易，常规培养下胚性愈伤诱导率分别为15.63%和10.33%。

根据“细胞的全能性”理论，每一个有活力的植物细胞都具有再现其完整植株的潜在能力。对于那些目前离体培养尚存在困难的草坪草品种，只是由于人们目前缺乏对它们的足够认识，还没有找到一种能使其外植体材料形成愈伤组织和再生绿苗的方法和途径[12-13]，并不一定是其本身缺乏出愈和再生能力。一旦找到了方法和途径，就会改变这种植物的外植体材料不易出愈和再生的状况。本研究中利用射线处理再生率极低的结缕草茎基愈伤组织后，使之胚性愈伤诱导率和再生率均大大提高。因此，不断地研究、摸索和掌握不同草坪草品种在组织培养中的适宜条件，找到能有效促进其愈伤组织形成和绿苗再生的方法和途径，对于发挥和挖掘组织培养技术在草坪草遗传改良中的作用和潜力具有十分重要的意义。

3.2诱变处理对结缕草胚状体的诱导 根据电离辐射理论，生物机体受伽玛射线等辐照后，会产生原始的生化损伤，代谢的方向性和协调性受到破坏，引起一系列生理和病理的变化。与此同时，机体在一定范围内进行着反馈调节，通过修补和修复，减轻这些损伤并恢复原状，在这一过程中就很容易产生基因的变异，这两种相反过程的消长和变化决定细胞的存活、死亡、老化、癌变等。当剂量较低时，修复过程占据了主导地位。如在本研究中，射线处理剂量在5～20 Gy时，体现出来的是对结缕草茎基的胚性愈伤组织形成、绿苗分化和再生有明显的促进作用。处理剂量20 Gy对形成茎基胚性愈伤组织效果最好，如YJ品种的茎基经射线处理后，胚性愈伤组织形成率增至64.71%，较0 Gy提高了48.80%；BJ的胚性愈伤形成率增至55.0%，较0 Gy提高了42.35%；QJ的胚性愈伤组织形成率增至37.5%，较0 Gy提高了35.11%。但当射线辐照剂量继续提高后，虽然对形成胚性愈伤组织和再生绿苗仍有促进作用，但射线的损伤效应也开始逐步增加，故综合效应表现为愈伤组织褐化死亡。

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