鼠尾胶原蛋白海绵止血作用研究

任海涛，钟志勇，严家荣，饶子亮，黄红坤，黄小琼，武 昕，唐小江

生物医学材料是近30年来发展起来的一类高技术新材料，其中的可吸收止血材料也随着交通意外、重大灾害等事故的增多逐渐引起医学界的关注。因此，止血效果确切、生物相容性好又能控制降解速率的生物医用止血材料成为人们关注和研究的主要对象。当前的生物止血材料主要有纤维蛋白胶、壳聚糖类止血材料、可吸收性明胶海绵、氧化纤维素等。纤维蛋白胶是从人或哺乳动物血中提取的一种生物止血黏合剂［1］，使用时要先溶解，不仅增加了储存和运输的难度，而且限制了应用［2］。壳聚糖是广泛存在于甲壳纲动物虾蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌和植物的细胞壁中的甲壳素经脱乙酰化后的一种天然的高分子材料，与人体生物相容性好，具有生物降解性［3］。其止血机制是通过对红细胞的作用，使红细胞发生聚集从而使血液凝固，但其止血作用有限［4］。明胶海绵是由从动物皮肤中提取并经纯化的明胶制作而成。明胶是胶原的水解产物，通过激活血小板，促进凝血块形成，达到止血目的［5］，其与血液形成的凝胶较易溶解［6］;同时，明胶海绵需机体的凝血因子参与才能止血，对凝血机制障碍者止血效果不理想［7］。氧化纤维素的止血机制是其分子中具有的酸性羧基与血红蛋白中Fe3+结合，形成棕色胶块，封闭毛细血管末段而止血［8］，但其酸性均能破坏凝血酶的止血作用［9］。胶原蛋白海绵作为一种新型的止血材料，利用其大面积的海绵结构破坏血小板来促进凝血过程。海绵在创面的溶解或降解而产生局部黏度变化从而促进凝血过程。鼠尾胶原蛋白海绵用于止血作用的研究还未见相关文献报道。本文研究鼠尾胶原蛋白海绵止血作用，为鼠尾胶原蛋白海绵用于止血、创面修复及进一步研究其止血机制提供事实依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新西兰兔，普通级，由广东省医学实验动物中心提供［生产许可证号 SCXK(粤)2008-0002］;使用许可证号［SYXK(粤)2008-0002］。本实验通过了广东省医学实验动物中心伦理审查委员会的审查，动物质量合格证编号0098038，实验编号SC11262。

1.1.2 仪器与试剂 30N冷冻干燥系统(宁波新芝公司);万分之一天平(德国Sartorius公司);SRMCD47医用保存柜(日本Sanyo公司);YP6000N系列电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

胶原蛋白海绵，广州创尔生物技术有限公司生产，批号20101203。麻醉药:赛拉嗪，吉林省敦化市圣达动物药品有限公司，批号20091206;戊巴比妥钠，广州白云区思乐实验仪器营业部，批号100808。

1.2 方法 实验方法采用低温冷冻干燥工艺制备鼠尾胶原蛋白海绵［10］，对鼠尾胶原蛋白海绵的止血疗效、止血可靠性及创面愈合、体内吸收情况进行初步研究，并用胶原蛋白海绵作参照。所用动物为2.0～3.0 kg的新西兰大白兔，随机分为对照组、胶原蛋白海绵组、鼠尾胶原海绵组。

1.2.1 鼠尾胶原蛋白海绵对新西兰兔耳部静脉出血的止血研究 联合麻醉对照组、胶原蛋白海绵组、鼠尾胶原海绵组，5只/组。在耳缘静脉周围处去毛并用手指轻弹若干次。每只兔分别于距耳尖部8 cm处割断耳缘静脉，自由出血5 s。5 s后对照组压敷消毒棉花、胶原蛋白海绵组压敷胶原蛋白海绵、鼠尾胶原海绵组压敷鼠尾胶原蛋白海绵。使用2 kg砝码作为外力进行伤口处按压，每隔30 s观察伤口的流血情况，并用药棉吸附所出血液。记录从切断静脉至不再出血的时间，同时观察压敷止血10 min、60 min、6 h、12 h、24 h、48 h 止血材料有无脱落和再出血现象。

1.2.2 鼠尾胶原蛋白海绵对新西兰兔耳部动脉出血的止血研究 分组和实验方法同1.2.1，每只兔分别于距耳尖部8 cm处割断耳缘动脉，记录从切断动脉至不再出血的时间，观察止血材料有无脱落和再出血现象的时间同1.2.1。

1.2.3 鼠尾胶原蛋白海绵对新西兰兔肝脏创面出血的止血研究 分组和实验方法同1.2.1，无菌条件下剖开动物腹腔暴露肝脏，用无菌手术刀在肝脏表面以“#”型进行2 cm×3 cm面积的划伤，每隔30 s观察伤口的流血情况，并用药棉吸附所出血液。记录从划伤肝脏至不再出血的时间。

1.2.4 鼠尾胶原蛋白海绵对新西兰兔股动脉割伤出血的止血研究 分组和实验方法同1.2.1，将实验动物固定在实验台，无菌条件下钝性分离股动脉，将股动脉切开3/4，每隔30 s观察伤口的流血情况，并用药棉吸附所出血液。记录从切伤股动脉至不再出血的时间。

2 结果

结果如表1所示，耳缘静脉出血:鼠尾胶原海绵组、胶原蛋白海绵组出血时间与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);而鼠尾胶原海绵组与胶原蛋白海绵组比较，差异无统计学意义。耳缘动脉出血:鼠尾胶原海绵组出血时间与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);与胶原蛋白海绵组比较，差异无统计学意义。肝脏出血:鼠尾胶原海绵组出血时间与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);与胶原蛋白海绵组比较，差异也有统计学意义(P＜0.05)。股动脉出血:鼠尾胶原海绵组出血时间与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);与胶原蛋白海绵组比较，差异也有统计学意义(P＜0.01)。

表1 鼠尾胶原蛋白海绵对新西兰兔耳缘静脉、耳缘动脉、肝脏、股动脉止血时间的影响(±s)

表1 鼠尾胶原蛋白海绵对新西兰兔耳缘静脉、耳缘动脉、肝脏、股动脉止血时间的影响(±s)

注:与对照组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01;与胶原蛋白海绵组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

对照组 5 744±411 396±162 1 080±460 1 440±560胶原蛋白海绵组 5 358±143△ 128±74△△ 596±183△ 448±68△△鼠尾胶原海绵组 5 318±115△ 112±99△△ 342±122△△＊ 204±311△△＊＊

耳缘静脉和耳缘动脉出血创面上分别用鼠尾胶原蛋白海绵和胶原蛋白海绵压敷止血10 min、60 min、6 h、12 h、24 h、48 h 均未观察到止血材料脱落和再出血的现象。肝脏出血创面在用鼠尾胶原蛋白海绵压敷止血后60 min观察期内均末见再出血和渗血现象，鼠尾胶原蛋白海绵和胶原蛋白海绵与创面黏附良好。止血材料与凝血块在创面上因为血液吸收和凝固形成完整覆盖物，未见渗血现象。对兔肝脏止血后7 d，鼠尾胶原海绵组和胶原蛋白海绵组均观察到创面局部的止血覆盖物已形成机化瘢痕组织并有膜组织与其粘连。15 d后可见鼠尾胶原蛋白海绵止血材料部分被吸收;30 d后创面局部形成纤维组织，止血材料被全部吸收。胶原蛋白海绵组情况与鼠尾胶原海绵组基本相似，但30 d后创面局部形成纤维组织比鼠尾胶原海绵组大。

3 讨论

本研究比较了胶原蛋白和鼠尾胶原蛋白海绵在止血方面的差异，通过对新西兰兔耳缘静脉、动脉、肝脏及股动脉创面止血效果的比较，进一步证明，鼠尾胶原有黏附创面性能好、创面干燥、不易发生感染、愈合迅速等特点［11］，在体内出血尤其是脏器表面止血发挥着重要的作用，而且其降解产物在较短时间内可被机体吸收;同时，在压敷肝脏和股动脉等出血时，鼠尾胶原蛋白海绵比胶原蛋白海绵有着更优异的止血性能。

胶原蛋白在自然状态下止血效果最好，不需要进行交联或变性成明胶，止血效率高，不良反应少，是一种理想的止血材料［12］。鼠尾胶原蛋白不仅能诱导血小板附着，产生释放反应，还能激活凝血因子，黏着在渗血的伤口上，对损伤的血管起填塞作用，其纤维状蛋白质与血液凝固中的纤维蛋白原比较接近，在体外单体可排列成纤维状结构，这种结构有利于血细胞黏附在上面形成血栓凝块，止血效率高，不良反应小，是一种理想的止血材料。这可能是因为鼠尾胶原蛋白主要为Ⅰ型胶原，存在真皮层且最普遍的以纤维形式形成胶原，由3股缠绕形成多肽链组，其结构和抗原性方面与人体组织的Ⅰ型胶原基本相同，具有低免疫源性、细胞适应性和细胞增殖作用、组织相容性、生物降解性等特性［13］。Ⅰ型胶原本身就是一种促进细胞贴壁生长的绝好材料，它具有引导上皮细胞迁入缺损区［14］，并在细胞迁移时起支持和润滑作用。因此，鼠尾胶原及其冻干海绵可以作为人工皮肤及创伤敷料研究的首选材料。本研究论证了鼠尾胶原是一种与人体生物相容性好、具有降解性、止血速度快、伤口恢复好并具有修复功能的新型医用止血材料，也为鼠尾胶原蛋白海绵用于止血、创面修复，并进一步研究其止血机制提供了事实依据。

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