应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性

许炎，张晨，徐庆文，黄江平，刘亚楠，邹凯南，平原，周怀谷

（上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室，上海 200083）

应用反转录PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场物证生物属性

许炎，张晨，徐庆文，黄江平，刘亚楠，邹凯南，平原，周怀谷

（上海市公安局物证鉴定中心法医物证学现场应用技术公安部重点实验室，上海 200083）

目的 探寻分子生物学方法判定刑事案件现场物证的生物属性的可行性。方法取30份现场生物检材，其中血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）各10份，分别进行常规检验法和分子生物学方法，通过DNARNA共提取技术，将其中的mRNA运用反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）技术反转录成cDNA，根据3种生物检材不同的目标基因设计3对特异性引物，进行实时荧光定量PCR扩增，通过熔解曲线测定不同的熔解温度（Tm）和不同长度的扩增片段来区分生物检材。结果血液（斑）的Tm值为（84.5± 0.2）℃，片段长度177bp；唾液（斑）的Tm值为（76.9±0.3）℃，片段长度134bp；精液（斑）的Tm值为（88.5± 0.2）℃，片段长度294bp。结论与常规检验法比较，联合应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定检材的生物属性特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠，可应用于日常法医物证检验。

法医遗传学；反转录PCR；实时荧光定量PCR；血液；唾液；精液

判定刑事案件中人体遗留的生物来源斑迹的属性，是法医物证工作者的一项首要任务和重要工作，为后期的DNA成功检验提供保障，同时也为案件侦破指明方向。血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）是案件中最常见的3种生物物证，在日常法医物证工作中，常规检验法普遍使用的是基于酶联免疫反应的金标试剂条和化学显色反应法判定检材的生物属性。虽然这些方法有快速、简便以及经济的优势，但特异性不高，会出现假阴性或假阳性的结果，还需损耗检验样品，对于一些案件中有重要价值的极微量检材，会造成严重的后果。

近年来分子生物学技术理论不断发展，细胞特异性的mRNA表达分析技术正成为判定检材生物属性的一种全新的方法，如血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）均有各自的细胞特异性基因标记，即胆色素原脱氨酶（porphobilinogen deaminase，PBGD）、富组蛋白3（histatin 3，HTN3）、（鱼）精蛋白2（protamine 2，PRM2）等[1-3]。通过NCBI检索可以得到不同生物检材各自的全长功能基因以此设计不同的引物，经PCR扩增得到相应的目标基因。

本研究联合运用反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）以及实时荧光定量PCR技术扩增得到相应的目标基因，并运用DNA-RNA共提取方法[4]，一次抽提同时完成前期生物属性判定和后期DNA检验。

1 材料与方法

1.1 样本

血液（斑）样本共10份：2份取自室内非正常死亡的2名死者的新鲜血液各100 μL，滴在1 cm×4 cm吸水滤纸上制成血痕，作为阳性对照；4份室内现场地面常规量新鲜血迹；4份分别取自木柄、墙面、门把手、衣服的微量血痕。

唾液（斑）样本共10份：2份取自2名健康男性志愿者的口腔拭子，作为阳性对照；4份来源为4名被害人现场采集的常规量口腔拭子；4份分别取自2封信件邮票背面的涂取物、1瓶现场提取的饮料瓶以及1份嚼过的口香糖中的微量唾斑。

精液（斑）样本共10份：2份取自2名健康男性志愿者的精液各20 μL，作为阳性对照；4份来源为4名嫌疑人遗留的避孕套中的常规量精液；4份分别取自床单、纸巾、内裤和阴道拭子中的微量精斑。

1.2 常规检验

血液（斑）样本：将10份样本用抗人血金标试剂条FOB（公安部二所物证鉴定中心）检测，按说明书操作。

唾液（斑）样本：将10份样本用淀粉-碘显色反应（自配）检测，按技术手册规范操作[5]。

精液（斑）样本：将10份样本用抗人精金标试剂条PSA（公安部二所物证鉴定中心）检测，按说明书操作。

1.3 DNA-RNA共提取

将所有样本按照AllPrepTMDNA/RNA Micro试剂盒（美国QIAGEN公司）说明书操作。总RNA用于反转录，基因组DNA用于定量和STR分型。

1.4 RNA反转录

将所有样本各自抽提的总RNA，使用TaqMan® Gold RT-PCR试剂盒（美国AB公司）说明书操作。反应体系均为10 μL，包括：10×TaqMan RT缓冲液1 μL、25 mmol/L MgCl22.2 μL、10 mmol/L dNTPs Mix 2μL、50μmol/L Oligo d（T）160.5μL、20U/μ LRNase抑制剂0.2 μL、50 U/μL MultiScribe反转录酶0.25 μL、RNA模板3.85 μL。反应条件为：25℃10 min，48℃30min，95℃5min。反应产物均为cDNA。

1.5 cDNA实时荧光定量PCR扩增

使用2×QuantiTechTMSYBR®Green PCR Master Mix试剂盒（美国QIAGEN公司），引物参照表1，配成10 μmol各取1 μL。反应体系为25 μL，包括：QuantiTechTMSYBR®Green PCR Master Mix（2×）12.5μL、10 mol/L引物（正向、反向）各1.25 μL、cDNA模板10μL。7500实时荧光定量PCR扩增仪进行检测。扩增条件：95℃15min；95℃20s，55℃20s，72℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。收集熔解曲线。

表1 不同生物检材样本的特定基因引物序列

1.6 扩增产物的电泳分析

各取5 μL PCR产物，用2%琼脂糖胶于1×TAE缓冲液中，150V电压电泳30min，EB染色，紫外光下观察条带。

1.7 DNA定量和STR分型

用QuantifilerTMhuman DNA定量试剂盒（美国AB公司）参照技术手册在7500实时荧光定量PCR仪上对基因组DNA进行TaqMan荧光探针法定量，反应体系为25 μL，包括：QuantifilerTMPCR Reaction Mix 12.5μL、QuantifilerTMHuman Primer Mix 10.5μL、DNA模板：2 μL。根据定量结果再按技术手册程序用AmpFℓSTR®Identifiler®试剂盒（美国AB公司）进行PCR扩增，反应体系为25 μL，后将扩增产物在3100XL遗传分析仪（日本HITACHI公司）上进行电泳。用GeneMapper v3.2进行DNA片段分析，观察STR基因座检出数。

2 结果

2.1 不同生物检材的熔解曲线

除唾液样本邮票1涂取物和精液样本阴道拭子上精斑外，其他样本均得到与阳性对照相同的特异性的熔解曲线。阳性对照的血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）的熔解曲线见图1，不同生物属性的检材有明显特异性的溶解曲线峰，与理论值相符。3种生物检材的熔解温度（Tm）见表2。

图1 3种生物检材的熔解曲线图

表2 不同生物检材的Tm值（n=10，±s，℃）

表2 不同生物检材的Tm值（n=10，±s，℃）

检材类型Tm血液（斑）84.5±0.2唾液（斑）76.9±0.3精液（斑）88.5±0.2

2.2 电泳结果显示的扩增基因片段长度

不同生物检材电泳条带清晰单一，扩增产物片段长度准确，血液（斑）片段长度177bp、唾液（斑）片段长度177 bp、精液（斑）片段长度294 bp，经割胶回收后测序验证，结果与目的基因序列完全一致（图2）。

图2 血液（斑）、精液（斑）和唾液（斑）特异性基因片段的电泳图

2.3 与常规检验的比较

在常规检验与分子生物学方法中，血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）的常规量12份样本以及阳性对照6份样本，均得到相同结果，显示为阳性，且全部获得清晰的STR分型图谱以及16个位点。而在12份微量样本中，常规检验与分子生物学方法存在差异（表3）。

表3 实际案件中不同生物微量检材两种方法的比较

微量血痕的常规检验法显示为阳性的，分子生物学方法全部获得清晰的STR分型图谱（16个位点），每个基因座都有一个基因峰（纯合子）或两个基因峰（杂合子），峰高大于100相对荧光强度单位；微量血痕的常规检验法显示为阴性的，分子生物学方法部分获得STR分型图谱（14个位点）。

微量唾斑的常规检验法显示为阳性的，分子生物学方法全部或部分获得STR分型图谱（＜10个位点）；微量唾斑的常规检验法显示为阴性的，分子生物学方法未获得STR分型图谱。

微量精斑的常规检验法显示为阳性的，分子生物学方法可能全部获得或未获得STR分型图谱。

3 讨论

在法医物证检验工作中，明确检材的生物属性是首要目标，决定了后续DNA检验的方法和成败。检验样本微量化是今后面临的巨大挑战，显然传统的免疫金标法无法适应这一趋势。本研究选择刑事案件中常见的三大生物检材血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）作为研究对象，运用分子生物学技术特异性扩增目标基因，通过熔解曲线和基因片段长度来判定检材的生物属性，为案件后续DNA检验提供线索。

近年来，RNA技术是法医物证学领域中一大研究热点，如判定血痕形成时间、特定基因在组织中表达谱等[6-7]。本研究应用RNA技术快速判定检材的生物属性，其原理是抽提细胞内总RNA经RT-PCR扩增为功能性DNA（cDNA），通过筛选血液（斑）、唾液（斑）、精液（斑）各自的标记性基因来设计不同的特异性引物，最后经实时荧光定量PCR扩增观察熔解曲线和基因片段长度来区分检材的生物属性。该方法在特异性方面较传统的免疫金标试剂条具有明显的优势，克服了假阴性、假阳性的缺点。本研究中，墙面上血迹FOB试剂条显示阴性，但得到血液特异性的熔解曲线和目的基因，并成功获得绝大部分STR分型；阴道拭子中PSA试剂条显示阳性，但未得到精液特异性的熔解曲线和目的基因，也未获得STR分型。从以上两个案例中，可以得知墙面上血迹中血红细胞本身数量较少且红细胞没有细胞核比白细胞脆弱，在渗透或外力作用下被大量破坏，低于试剂条的检测阈值，出现假阴性结果。而PSA试剂条是根据人精浆前列腺特异性抗原P30，与精液中有无精子没有关系。阴道拭子中可能仅有P30，并无精子（实验过程中镜检也未检见精子），出现假阳性结果。上述结果说明DNA检验与运用RNA判定生物属性的方法都是在基因水平的检测，而免疫金标法却是在蛋白水平上的检测，FOB试剂针对血红蛋白而非白细胞，PSA针对P30而非精子细胞，因此特异性不高。本研究运用分子生物学技术判定是否为唾液（斑）的方法，较淀粉-碘显色反应更精确、特异性更强，与DNA检验结果相吻合。

此外，本研究采用DNA-RNA共提取方法，可以做到一次分离、多种用途，最大程度地利用有限的生物检材，蛋白质可以用免疫酶联试剂条做前期检验（与后面的RNA方法作相互验证）、RNA通过反转录成为功能性cDNA用于判定检材的生物属性和推断生物检材的形成时间、基因组DNA可用于STR分型。该技术尤其适用于重特大案件中重要且微量的生物检材的检验，在一次检验过程中得到多种信息，既经济又快速。

运用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术判定现场检材的生物来源属性，较传统的免疫酶联试剂条前期检验方法具有特异性强、同步检验并最大程度利用样本的优势，尤其适用于微量检材。

[1]Juusola J，Ballantyne J.Messenger RNA profiling：a prototype method to supplant conventionalmethods for body fluid identification[J].Forensic Sci Int，2003，135（2）：85-96.

[2]Juusola J，Ballantyne J.Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids[J].Forensic Sci Int，2005，152（1）：1-12.

[3]Nussbaumer C，Gharehbaghi-Schnell E，Korschineck I. Messenger RNA profiling：a novel method for body fluid identification by real-time PCR[J].Forensic Sci Int，2006，157（2-3）：181-186.

[4]Bauer M，Patzelt D.A method for simultaneous RNA and DNA isolation from dried blood and semen stains[J]. Forensic Sci Int，2003，136（1-3）：76-78.

[5]侯一平.法医物证学[M].北京：人民卫生出版社，2009：337.

[6]Haas C，Klesser B，Maake C，et al.mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR[J].Forensic Sci Int Genet，2009，3（2）：80-88.

[7]Bauer M.RNA in forensic science[J].Forensic Sci Int Genet，2007，1（1）：69-74.

Determination of the Biological Attribute of Evidence at the Scene Using Reverse Transcription PCR and Real-time Fluorescent Quantitative PCR

XU Yan,ZHANG Chen,XU Qing-wen,HUANG Jiang-ping,LIU Ya-nan,ZOU Kai-nan,PING Yuan, ZHOU Huai-gu
（Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology,Ministry of Public Security,Institute of Forensic Science,Shanghai Public Security Bureau,Shanghai 200083,China）

ObjectiveTo explore the feasibility of biological method to identify the biological attribute of samples at crime scene.MethodsThirty samples of ten blood stains,ten saliva stains and ten semen stains were selected,and all the samples were processed by the routine method and biomolecular method,respectively.Both RNA and DNA were isolated using DNA-RNA co-extraction technology and the mRNA was converted into cDNA using reverse transcription PCR（RT-PCR）.Three pairs of specific primers were designed for blood stain,saliva stain and semen stain based on the different target genes in three specific tissues and the primers were amplified using real-time fluorescent quantitative PCR.The differences in these biological samples were evaluated by melting temperature（Tm）values and the size of the amplification fragment.ResultsThe Tm values of blood stain,saliva stain and semen stain were（84.5±0.2）℃,（76.9±0.3）℃and（88.5±0.2）℃,respectively.The length of PCR fragments of them was 177 bp,134 bp and 294 bp,respectively.ConclusionCompared with the routine method,RT-PCR with real-time fluorescent quantitative PCR is highly specific,sensitive and reliable to identify the biological attribute of evidence,and can be potentially applied to determine evidence attribute in forensic practice.

forensic genetics;reverse transcriptase polymerase chain reaction;real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction;blood;saliva;semen

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.006

1004-5619（2013）04-0259-04

2012-10-08）

（本文编辑：李成涛）

公安部科技强警基础工作专项项目（2012GABJC005）

许炎（1980—），男，江苏苏州人，博士研究生，主检法医师，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：xxnnxy@hotmail.com

周怀谷，男，博士，主任法医师，主要从事法医DNA分析技术的应用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com