利用人体外周血痕sjTREC含量推断个体年龄

曲冬阳，邓淑娇，葛芸英，陈松，欧雪玲

（1.中山大学中山医学院法医物证教研室，广东广州 510080；2.广州市公安局白云区分局，广东广州 510420；3.公安部物证鉴定中心法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038）

利用人体外周血痕sjTREC含量推断个体年龄

曲冬阳1，邓淑娇2，葛芸英3，陈松3，欧雪玲1

（1.中山大学中山医学院法医物证教研室，广东广州 510080；2.广州市公安局白云区分局，广东广州 510420；3.公安部物证鉴定中心法医遗传学公安部重点实验室，北京 100038）

目的 验证人外周血中信号结合T细胞受体删除DNA环（signal joint T-cell receptor excision DNA circle，sjTREC）水平与年龄的相关性公式，探讨其在鉴定实践中的应用价值。方法收集已知年龄的健康无关个体外周血痕样品30例，室温放置4周后，分别提取血痕DNA。通过实时荧光定量PCR技术，定量测定外周血痕DNA中sjTREC含量，并选择人TATA盒结合蛋白（TATA box binding protein，TBP）序列作为内参基因。采用年龄推断公式Age=-7.1815Y-42.458±9.42（Y=dCtTBP-sjTREC）推算血痕的供体年龄，并与供体实际年龄作比较，验证方法准确性。结果在收集的30例血痕样品中均能检测到目的基因sjTREC和内参基因TBP。外周血痕sjTREC含量随供体年龄的增长而降低（P＜0.01）。采用本方法推断血痕个体年龄的准确率为76.67%。结论利用sjTREC含量推断血痕个体年龄的方法简单、快速、灵敏、种属特异性好，具有重要的应用前景。

法医遗传学；血液；信号结合T细胞受体删除DNA环；年龄

在法医学实践中，个体年龄是一个非常重要的表型特征。当生物学检材如外周血标本等不具备形态学信息时，根据分子生物学的方法可得到与年龄相关的一些有效信息。信号结合T细胞受体删除DNA环（signal joint T-cell receptor excision DNA circle，sjTREC）产生于T细胞发育早期T细胞受体α（T cell receptor α，TCRα）基因重排过程中，其作用是作为初始T细胞的标志而反映胸腺的近期输出功能。本研究前期实验[1]已表明，人体外周血sjTREC含量随个体年龄的增长而降低，并同时对264例0～86岁健康无关个体的新鲜血痕作sjTREC定量分析，归纳出年龄推断的回归方程为Age=-7.181 5 Y-42.458±9.42（Y= dCtTBP-sjTREC）。然而，在法医学实践中，现场除了新鲜血痕外，陈旧血痕也并不少见。本研究采用实时荧光定量PCR技术，对30例在室温下放置4周的正常人外周血痕中sjTREC水平做定量分析，从而模拟陈旧血痕，观察其与个体年龄的相关性；并利用上述已推导出的回归方程推断其年龄，通过与样本实际年龄对比，验证方法准确性以探讨其在法医学实践中的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 引物和探针设计

在TCRδ基因组序列（ACCESSION：AE000521）中于δRec基因片段的下游设计1段下游引物（P1：5′-CCATGCTGACACCTCTGGTT-3′），在ψJα的上游设计1段上游引物（P2：5′-TCGTGAGAACGGTGAATG AAG-3′），引物的方向与一般的PCR引物相反。由于在δRec和ψJα两个基因片段删除重组形成一环形DNA，其方向与原方向相反（图1），当形成DNA环，才能扩增得到PCR产物，即sjTREC特异PCR引物设计的原理。同时在该扩增片段中间设计1段Taqman荧光素标记探针（T1：5′-FAM-CACGGTGATGCATAG GCACCTGC-TAmRA-3′）。作为细胞定量对照，选择人TATA盒结合蛋白（TATA box binding protein，TBP）基因作对照：分别在TBP基因组序列（ACCESSION：NG008165）中设计一对引物（P3：5′-TTAGCTGGCTCT GAGTATGAATAAC-3′和P4：5′-AACCAATAAAACC TACTCCTCCCTTAA-3′）及1段Taqman荧光素标记探针（T2：5′-FAM-CAGTCCAGACTGGCAGCAAGAA AAT-TAMRA-3′）。

图1 sjTREC特异PCR引物设计原理

1.2 人外周血痕样本的制备

收集30例人外周血痕样本，入选者年龄为0.3（4个月）～78岁的健康志愿者，其中男性16例，女性14例。经体检，入选者外周血常规均正常。征得同意后，采集外周静脉血1mL，经EDTA-K2抗凝处理后，取300μL滴加于消毒的干净滤纸上，室温晾干后继续放置4周，采用E.Z.N.A.®Forensic DNA Kit（美国Omega公司）提取血痕DNA，DNA样本编号（1～30）后放于-20℃冰箱冻存。

1.3 实时荧光定量PCR技术

PCR反应体积20 μL，包括：2×Premix Ex TaqTM10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，探针0.5μL，DNA模板4μL，其余用水补足。反应条件：95℃5min；95℃15s，60℃15s，72℃32s，40个循环。

1.4 检测样本中sjTREC含量

使用以上实时荧光定量PCR反应系统对上述30例人外周血痕样本中sjTREC的含量进行定量检测。每一样本分别进行3次sjTREC和3次TBP的检测，并分别计算sjTREC和TBP基因的平均Ct值，sjTREC含量以ΔCt值=平均CtTBP-平均CtsjTREC表示。

1.5 灵敏度和种属特异性检测

选取7号（年龄＜30岁）、30号（年龄＞70岁）DNA样本，分别用Gene Quant pro紫外分光光度仪（瑞典Amersham Pharmacia公司）定量后用灭菌水稀释为5、10、25、50、75、100、125ng/μL，用上述方法进行sjTREC的检测，验证本方法的灵敏度。同时采集狗、猪、牛、鱼、鸡的血痕样本，用上述方法进行血痕DNA的提取和sjTREC含量检测，验证方法的种属特异性。

1.6 方法验证

对上述30例人外周血痕样本进行方法验证，利用已推导出的回归方程Age=-7.1815Y-42.458±9.42（Y=dCtTBP-sjTREC），其中±9.42岁为该公式在推断个体年龄中的标准差，在此标准差范围内判定为准确[1]，以此来推断血痕的供体年龄，通过与样本实际年龄对比，验证方法的准确率。

2 结果

2.1 外周血痕sjTREC水平的测定结果

30例供体血痕的基因组DNA经实时定量扩增后，均可见清晰的扩增曲线；由图2可见，外周血痕sjTREC含量（ΔCt值）随供体年龄的增加而降低（P＜0.01）。

图2 ΔCt值与年龄相关性的散点图

2.2 灵敏度和种属特异性检测结果

灵敏度：对7号、30号不同供体年龄血痕DNA的sjTREC检测显示，当血痕供体年龄为27岁时（7号样本），起始DNA模板量≥10 ng可得到稳定且理想的sjTREC扩增曲线图；当血痕供体年龄为78岁时（30号样本），起始DNA模板量≥100ng可得到稳定的扩增曲线图。因此，当血痕供体年龄不明确时，应使用的血痕最低模板DNA量为100ng。

种属特异性：采用本方法对狗、猪、牛、鱼、鸡等动物DNA样本进行检验，均未获得扩增结果。

2.3 血痕的供体年龄推断

据方程Age=-7.1815Y-42.458±9.42（Y=dCtTBP-sjTREC），将以上30例外周血痕DNA样本的ΔCt值分别代入年龄推断方程，可获得血痕供体的推断年龄，各血痕供体的实际与推断供体年龄结果见表1。结果显示，使用该公式对30例血痕样本进行供体年龄推断，有23例的供体年龄推断与实际年龄差值小于9.42岁，准确率为76.67%。

表1 30例血痕样本推测年龄结果（岁）

3 讨论

目前，应用于血痕年龄推断研究的分子生物学标记主要包括端粒DNA限制性酶切片段长度[2]、线粒体DNA 4977bp片段缺失程度[3]、DNA甲基化水平[4]等，均与个体年龄及衰老密切相关，但都有各自的局限。测量端粒DNA长度对DNA的完整性要求高，血液样本的需要量较大；线粒体DNA测量主要适用于20岁以上个体的年龄推测，在极高龄老人和有心脏病或其他病患的人群中使用线粒体DNA推测年龄并不可靠[5]；DNA甲基化研究仍处于初级阶段，尚无成熟的数量关系理论[6]。鉴于此，国际法医年龄推断学会（Study Group on Forensic Age Diagnostics）提出，使用分子生物学方法推断生物检材的个体年龄时，应尽可能使用多种不同的生物指标，以提高年龄推断的准确性[7]。因此，寻找更多与个体年龄紧密相关的新指标，建立推广性强的检测方法，将能对现有的生物检材个体年龄推断方法作有益的补充，从而提高年龄推断的准确性。

本研究采用实时荧光定量PCR技术，对30例在室温放置4周的正常人外周血痕ΔCt值做定量分析。结果显示，30例供体年龄为0.3（4个月）～78岁的外周血痕均能检测到sjTREC基因，表明本法的年龄适用范围广；外周血痕ΔCt值随供体年龄的增加而降低（P＜0.01），与前期研究结果[1]基本一致；当血痕供体年龄不明确时，最低模板DNA量为100 ng，灵敏度较高，并具有较好的人类种属特异性。利用前期基于新鲜血痕研究所建立的年龄推断公式Age=-7.181 5 Y-42.458±9.42（Y= dCtTBP-sjTREC）推断30例血痕供体年龄，其中有23例与实际年龄的差值小于9.42岁，准确率为76.67%，表明该公式也适用于放置4周内的血痕样本供体年龄推断。在进一步的研究中，可通过结合其他与年龄相关的生物学指标，包括端粒DNA限制性酶切片段长度、线粒体DNA 4977bp片段缺失程度、DNA甲基化水平等，考察温度、湿度、光照等环境因素对sjTREC含量的影响，以提高血痕供体年龄推断的准确性。

此外，本研究使用TaqMan探针实时荧光定量技术，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、定量准确、重复性好、速度快，在法医学研究和应用中具有一定的应用前景。

[1]Ou XL，Gao J，Wang H，et al.Predicting human age with bloodstains by sjTREC quantification[J].PLoS One，2012，7（8）：e42412.

[2]Ren F，Li C，Xi H，et al.Estimation of human age according to telomere shortening in peripheral blood leukocytes of Tibetan[J].Am J Forensic Med Pathol，2009，30（3）：252-255.

[3]Meissner C，von Wurmb N，Oehmichen M.Detection of the age-dependent 4977bp deletion of mitochondrial DNA.A pilot study[J].Int JLegal Med，1997，110（5）：288-291.

[4]Bocklandt S，Lin W，Sehl ME，et al.Epigenetic predictor of age[J].PLoS One，2011，6（6）：e14821.

[5]徐晓玲，郑卫平，黄君键.线粒体DNA和端粒与年龄相关性的研究进展[J].中国法医学杂志，2005，20（6）：347-349.

[6]徐隆昌，易少华，黄代新，等.DNA甲基化及其与个体年龄相关性研究[J].中国法医学杂志，2011，26（4）：295-297.

[7]Schmeling A，Grundmann C，Fuhrmann A，et al.Criteria for age estimation in living individuals[J].Int J Legal Med，2008，122（6）：457-460.

Age Estimation Using Content of sjTREC in Human Peripheral Blood

QU Dong-yang1,DENG Shu-jiao2,GE Yun-ying3,CHEN Song3,OU Xue-ling1
（1.Faculty of Forensic Medicine,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080, China;2.Baiyun District Sub-bureau,Guangzhou Municipal Public Security Bureau,Guangzhou 510420, China;3.Key Laboratory of Forensic Genetics,Institute of Forensic Science,Ministry of Public Security, Beijing 100038,China）

ObjectiveTo determine and verify the correlation formula of age estimation using the content of signal joint T-cell receptor excision DNA circle（sjTREC）in human peripheral blood and to discuss its application value in forensic biological practice.MethodsThe samples of peripheral blood stains were collected from 30 healthy unrelated individuals whose ages were known.The DNAs were extracted from the samples stored at room temperature after 4 weeks.The content of sjTREC was measured by real-time fluorescent quantitative PCR technique,and the TATA box binding protein（TBP）was selected as reference genes.The age of each sample was predicted with the formula which was Age=-7.1815Y-42.458±9.42（Y=dCtTBP-sjTREC）,and the result was compared with the real age of each individual to determine the accuracy of the formula.ResultssjTREC and TBP gene were detectable in all 30 samples of peripheral blood.The contents of sjTREC in human peripheral blood showed a decreasing tendency with aging.The accuracy rate for the age estimation by this method was 76.67%.ConclusionThe method for the age estimation with the content of sjTREC was simple,fast,sensitive,and good species specific with important potential application prospect.

forensic genetics;blood;signal joint T-cell receptor excision DNA circle;age

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.04.005

1004-5619（2013）04-0256-03

2013-06-03）

（本文编辑：李成涛）

国家自然科学基金资助项目（81001352）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2011JB007）；中央高校基本科研业务费中山大学青年教师培育计划项目（12ykpy04）

曲冬阳（1988—），男，硕士研究生，主要从事法医物证学研究；E-mail：qudongyang1988@hotmail.com

葛芸英，女，硕士，副主任法医师，主要从事法医遗传学研究；E-mail：easygyy@yahoo.com.cn