葡萄籽原花青素对睡眠呼吸暂停模式低氧大鼠海马区磷酸化p38MAPK 和IL-1β 表达的影响
2013-03-11赵雅宁刘文倩王红阳景丽伟
赵雅宁,刘文倩,王红阳,窦 娜,郭 霞,景丽伟
原花青素是天然植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称,属于植物多酚类物质,以葡萄籽中含量最为丰富。研究表明葡萄籽原花青素具有抗氧化、清除自由基、心血管保护、降血脂、抗肿瘤等功能[1~4]。目前有关葡萄籽原花青素对中枢神经系统作用研究较少。阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep ap1nea-hypopnea syndrome,OSAHS)因睡眠过程反复发生的低氧/再复氧,可造成心、脑、肾等重要器官的损伤[5,6]。临床上OSAHS患者表现警觉、执行能力和运动协调方面的认知障碍,且与血管性痴呆的形成密切相关[6]。本研究采用在睡眠呼吸暂停模式慢性间歇性缺氧模型,探讨葡萄籽原花青素对睡眠呼吸暂停模式低氧大鼠学习记忆和海马区磷酸化p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和白介素-1β(IL-1β)表达的影响,为中药的进一步开发和利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物、试剂及仪器 雄性SD 大鼠80只(北京维通利华公司,合格证SCXK(京)2002-003),体质量310~350g;H-7650 透射电镜(日本日立公司);测氧仪(建德市梅城电化分析仪器厂);低氧控制程序(天津医科大学总医院呼吸科);纯氮(天津六方气体高科技有限公司);低氧舱(天津医科大学研制)。
1.2 动物分组和模型制备 80 只雄性SD 大鼠随机分成对照组、模型组及高、低剂量葡萄籽原花青素干预组,各组动物20 只。模型组:模拟临床临床呼吸暂停事件,建立OSAHS 模式间歇低氧动物模型:每天8:00Am~4:00Pm 将实验动物置于模型舱内,向舱内循环充入氮气和空气,每组每次循环2min,连续给予氮气30s,维持舱内氧浓度最低至5%(50ml/L),随后均复氧至氧浓度21%(210ml/L)。对照组持续充入压缩空气。用数字测氧仪监测舱内氧浓度变化,使舱内氧浓度维持在各自的氧浓度内,使其氧浓度波动范围在±0.5%以内;每天实验8h,实验持续时间为2 和6w。干预组在动物进入低氧模型舱前2w 开始每天灌胃给药1 次,持续给药8w,剂量分别为:高GSP200mg/kg、低100mg/kg。分别在实验2w 和6w 进行所设指标检测。
1.3 脑组织形态结构观察(电镜)常规麻醉动物,开胸、暴露心脏,用混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸缓冲液)心脏灌流,断头取脑,取大脑海马组织,切成1mm×1mm×1mm 组织块,立即以40ml/L 戊二醛固定,0.1mol/L 二甲砷酸缓冲液冲洗两遍,再经40ml/L 四氧化锇固定,缓冲液冲洗,逐级丙酮脱水,环氧树脂浸透,包埋,超薄切片,醋酸铀枸橼酸铅双重染色,透射电镜下观察脑组织超微结构并摄片。
1.4 磷酸化P38MAPK 和IL-1β 蛋白质印迹检测 大鼠致死后,迅速取双侧海马区组织,称量0.6g,4℃PBS 充分洗涤,加入3 倍体积的4℃全细胞裂解液,冰浴中匀浆,4℃离心5min,12000 r/min,取上清。考马斯亮蓝(南京建成生物有限公司)法测各样本的蛋白含量,样本贮存于-80℃备用。检测步骤:蛋白样品40μg 与等体积上样缓冲液混合,煮沸10min,100g/L 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜,封闭液室温下震荡2~3h,加入抗体(美国Cell Signaling 公司,磷酸化P38MAPK和IL-1β 浓度均为1∶2000),4℃孵育过夜,TBST 洗膜,标记的二抗,37℃孵育1h,TBST 洗膜,ECL 显色,用图像分析仪测定光密度,作定量分析。
1.5 学习记忆功能检测 按照Smith 等[7]的方法,采用Morris 水迷宫进行检测。每只动物晨起训练5 次后分别在上午、下午各测试6 次,分别记录各组大鼠逃避潜伏期时间单位为秒(s);及撤去平台后动物穿越原平台位置的次数,取检测记录的总均值。
1.6 统计学处理 应用SPSS17.0 统计分析软件对数据进行数据处理,检验方法为组间分析采用析因设计资料的方差分析,组内分析采用SNK-q 分析。数据以±s 表示,P<0.05 为有显著性意义。
2 结果
2.1 各组神经细胞超微结构的改变 对照组神经细胞形状规则,胞质内线粒体丰富,胞核形状规则,核膜完整,染色质均匀,电子透明度高。模型组细胞外形不规则,多数线粒体嵴断裂、减少、甚至出现大量空泡、消失或难以辨认,染色质聚集靠边等;葡萄籽原花青素组神经细胞超微结构减轻,高剂量组尤为明显(见图1~图5)。
2.2 各组海马区磷酸化p38MAPK 和IL-1β 表达变化 免疫印迹法检磷酸化p38MAPK 和IL-1β蛋白表达水平:以β-actin 校准后的蛋白条带IOD 值反映其蛋白水平。与对照组比较,模型组脑组织海马区磷酸化p38MAPK 和IL-1β 表达增高,且随低氧时间时间的延长,磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白水平进一步增高;与间模型组比较,葡萄籽原花青素可有效降低磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白水平,且在高剂量葡萄籽原花青素组减低更为显著(见表1)。
2.3 各组水迷宫检测结果 与对照组相比,模型组动物的大鼠逃避潜伏期时间均延长、穿越原平台位置的次数均减少;与模型组比较,葡萄籽原花青素组能显著缩短大鼠逃避潜伏期时间、增加原平台位置的次数(P<0.05)(见表2)。
表1 各组海马区磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白的比较(±s)
表1 各组海马区磷酸化p38MAPK 和IL-1β 蛋白的比较(±s)
与对照组比较* P<0.05;与模型组比较△P<0.05;与低剂量组比较▲P<0.05
表2 各组动物水迷宫检测结果的比较(±s)
表2 各组动物水迷宫检测结果的比较(±s)
与对照组比较* P<0.05;与模型组比较△P<0.05;与低剂量组比较▲P<0.05
图1 对照组大鼠海马区神经元形态变化(电镜×20000)
图2 模型组2w 大鼠海马区神经元形态变化(电镜×20000)
图3 模型组6w 大鼠海马区神经元形态变化(电镜×20000)
图4 低剂量组6w 大鼠海马区神经元形态变化(电镜×20000)
图5 高剂量组6w 大鼠海马区神经元形态变化(电镜×20000)
3 讨论
本研究发现葡萄籽原花青素可减轻OSAHS 模式间歇性低氧大鼠海马区神经细胞形态损伤,改善动物学习记忆功能,说明葡萄籽原花青素对OSAHS导致的神经损伤有一定的保护作用。OSAHS 特征性的低氧方式是慢性间歇低氧,这种缺氧-复氧方式对神经的损伤现类似脑缺血/再灌注,产生大量的活性氧,引起脑内强烈氧化应激,导致神经元的损伤,学习记忆受损[8],因此给予具有较强抗氧化、清除自由基作用的葡萄籽原花青素对OSAHS 诱导神经损伤有较好保护作。谭毓治[9]曾报道葡萄籽原花青素能改善D-半乳糖所致衰老小鼠的学习记忆能力,与其能降低血液和脑组织中过氧化脂质有关。
本研究发现葡萄籽原花青素可抑制OSAHS 模式间歇性低氧大鼠脑内p38MAPK 的活性和炎症因子IL-1β 的表达。p38MAPK 是有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成员,其活化对学习记忆的影响主要表现负性作用。研究显示p38MAP 活化后经多级激酶反应介导凋亡基因或蛋白表达,导致神经细胞的死亡,学习记忆损伤[10];此外,p38MAP 活化直接对海马神经突触可塑性产生损伤,导致长时程增强(LTP)的受损从而致空间学习能力受损[11]。炎症因子IL-1β 可通过核转录因子kappa B(NF-κ B)激活巨噬细胞及其他细胞分泌粘附因子、IL-6、IL-8 等产生,促进脑缺血缺氧后脑组织炎症损伤的加剧,神经功能受损。此外,IL-1β 可影响脑细胞对神经活性物质、神经营养因子的释放和再摄取、调控输入与输出关系的反应环路、影响突触的可塑性和LTP 等,在认知功能方面具有重要作用[12,13]。本研究中给予葡萄籽原花青素干预后,动物学习记忆明显改善,同时二者表达水平呈剂量依赖式显著下降,说明葡萄籽原花青素通过抑制p38MAPK 信号活化、减少IL-1β表达而改善OSAHS 模式低氧大鼠的认知行为。
总之,本实验结果表明葡萄籽原花青素可以通过降低脑组织海马区p38MAPK 信号活化、减少IL-1β 表达,而改OSAHS 模式低氧导致的动物认知功能损伤。葡萄籽原花青素具有多种药理活性,其改善OSAHS 神经损伤的其它机制有待进一步探讨。
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