同型半胱氨酸对BMVECs 凋亡相关基因BCL-2/BAX 表达的影响

孙文萍，谢春香，赵节绪

高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)引起动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的机制还不完全清楚，但是研究发现，同型半胱氨酸可以破坏血管内皮细胞，促进其凋亡，造成内皮功能障碍［1，2］，这是其中一项重要的机制。本实验通过培养大鼠的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells，BMVECs)，研究同型半胱氨酸促使BMVECs 产生凋亡的可能途径。

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI-1640 培养基、优质胎牛血清(Gibco，美国);胶原酶Ⅱ型(sigma，美国)、促内皮细胞生长因子(Roche，美国)、D，L-homocysteine(Hcy)(Sigama美国)、生物素化山羊抗兔IgG(北京中山试剂公司)、兔抗NF-κB p65 多克隆抗体(Santa Cruz，美国)，总RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒购自Sigama，逆转录-聚合酶链反应试剂盒、引物购自上海生工。

1.2 方法

1.2.1 BMVECs 细胞培养及鉴定

本实验室已经培养成功并通过Ⅷ因子抗原免疫染色鉴定的大鼠BMVECs，取第三代细胞用于实验。

1.2.2 MTT 实验

按1×103～1×104/ml 密度接种细胞于96 孔培养板中，分成两大组，待细胞贴壁后一组加不同浓度药物(Hcy 50μmol/L、Hcy 200μmol/L、Hcy 1000μmol/L、Hcy 2000μmol/L)和CuSO4(4μmol/L)共同培养18h;另一组只加不同浓度的Hcy 进行培养，每种浓度平行8 孔;另设对照组。干预18h 后每孔加入MTT 溶液20ml，37℃，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，然后每孔加入150ml DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解;选择570nm波长，以空白培养液调零点，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值A，记录结果。实验重复3 次，绘制时间、剂量效应曲线。

1.2.3 细胞免疫化学法(ABC 法)检测NF-κB p65 的表达

细胞爬片后固定、封闭，分别加入一抗和二抗后显色，于Luzex-F 图像分析仪(加拿大)下计数每张片子5 个视野的NF-κB p65 阳性细胞率。

1.2.4 蛋白质免疫印记分析(Western-bolt 法)NF-κB p65 的表达

取1×107细胞提取胞核蛋白，电转膜法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的PBS液浸泡硝酸纤维膜，以封闭非特异抗体结合。加入一抗兔抗NF-κB p65 多克隆抗体(1∶1000)，常温下摇振4h，加二抗HRP 羊抗兔IgG(1∶5000)常温下摇振2h。ECL 检测试剂盒显影，X 线压片曝光，HPIAS-1000 型图像分析系统分析结果。

1.2.5 RT-PCR 法检测Bax 及Bcl-2 的表达

BMVECs 分为4 组，分别加入1mmol/L 的Hcy及4μmol/L CuSO4，各培养0、6、12 和18h 后，分别收集细胞，提取总RNA，以2μg 总RNA 进行反转录。扩增Bcl-2(正义引物:5 ’-CACCC2CTGGCATCTTCT-CCTT-3’，反义引物:5’-CACAATCCTCCCCCAGTTCACC-3’，)，扩增产物长度为304bp;Bax(正义引物:5’-ATGGCTGGGGAGACACCTGAG-3 ’，反义引物:5 ’-CTAGCAAAGTAGAAGAGGGCAAC-3’);，扩增产物长度为240 bp;内参照β-actin(正义引物:5’-TTGTAACCAACTGGGACGATATGG-3’，反义引物:5 ’-GATCTTGATCTTCATGGTGCTAGG-3’)，扩增产物长度为764 bp。扩增条件:94 ℃变性1min，55 ℃退火1min，72 ℃延伸2min，循环35 次。扩增完毕后取PCR 产物10μl 于1.5%的琼脂糖凝胶电泳上检测，凝胶图像分析仪(法国VL 公司，Bio-ID)分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MTT 结果

细胞培养18h 后，我们发现，单独添加Cu-SO(4μmol/L)组的细胞存活率没有受到影响;培养液中不含CuSO4(4μmol/L)时，各Hcy 浓度组细胞OD570 值无显著区别(P＞0.05);当培养液中添加CuSO4(4μmol/L)时，Hcy 浓度为1mmol/L 及2 mmol/L 的两组细胞OD570 值明显降低(P 分别为0.034 和0.006)，而 Hcy 浓度为50μmol/L、200μmol/L 的两组细胞OD570 值较对照组差异不显著(P＞0.05))。因此以后的试验中，我们选用的Hcy 干预浓度为1 mmol/L(含CuSO44μmol/L)。

2.2 NF-κB p65 表达的免疫细胞化学检测

正常情况下，即血管内皮细胞未受到外界刺激时，由于NF-κB 和IκB-α 蛋白质结合成三聚体形式存在于细胞质，NF-κB 处于未活化状态。故1mmol/L 的Hcy+4 μmol/L CuSO4干预细胞后，0h 组细胞染色后NF-κB p65 只在细胞浆表达，胞浆染色淡;6h后，NF-κB 不仅在细胞浆内表达增强，而且转入细胞核内表达，发生核转移，谓之阳性细胞(P＜0.05)，在12h 时达高峰，细胞核着色明显，阳性细胞百分数显著增多(P＜0.01);而到18h 时，NF-κB 核转位的现象开始减弱(P＞0.05)。

2.3 NF-κB 表达的Western-blot 法检测

Western 印迹杂交结果与免疫细胞化学结果基本一致。在对照组细胞的核蛋白提取液中，基本没有NF-κB 的表达;1.0mmol/L Hcy+4 μmol/L Cu-SO4刺激细胞6h 出现核蛋白提取液中NF-κB 的表达，12h 时达高峰，到18h 时表达减少。

2.4 Bax 及Bcl-2 mRNA 的表达

Hcy 作用后0～18h，细胞Bcl-2 mRNA 水平逐步降低，而Bax mRNA 水平逐步升高。二者的比值呈下降趋势(见图1～图4)。

图1 不同时间点Bcl-2 与β-actin 的mRNA 比值

图3 不同时间点Bax 与β-actin 的mRNA 比值

图4 不同时间点Bax 的mRNA 表达

3 讨论

细胞凋亡是一个极其复杂、精密的过程，涉及到许多事件的发生，包括凋亡相关基因表达的升高或下调等。已证实，细胞凋亡的发生主要通过两条途径产生:即线粒体凋亡途径和死亡受体(Fas-FasL)介导的途径［3］。在病理条件下，Hcy 攻击的主要靶细胞是血管内皮细胞，它可以造成血管内皮细胞凋亡，是发生动脉硬化的始动部位。有研究认为，Hcy可以通过多方面的作用引起内皮细胞凋亡。Austin认为Hcy 诱导的内皮细胞凋亡主要有两个途径［4］:其一为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)介导的细胞凋亡;此外，胱冬酶-3(caspase-3)的激活是Hcy 引起细胞凋亡的另一机制。Hcy 能造成细胞内ROS 增加，使线粒体失去正常的跨膜电位，导致细胞色素C(cytochrome-c)的释放，进而激活caspase9、6、3，最后出现核蛋白降解，DNA 断裂，细胞死亡［5］。Kerkeni 发现，Hcy 的衍生物同型半胱氨酸硫内酯(homocysteine thiolactone)，通过激活caspase-3 使人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)细胞DNA 断裂，细胞死亡［6］。在这一病理过程中，caspase-3 和线粒体细胞色素C 的活性和释放均明显增加［7］。在caspase-3 和线粒体细胞色素C 介导的线粒体凋亡途径中，线粒体膜通透性转变孔(permeablity transition pore，PTP)的开放和关闭是决定细胞是否发生凋亡的关键［8］。而Bcl-2 家族成员对细胞凋亡的调控主要是通过调控线粒体的PTP 的开放和关闭来实现的。其中Bcl-2 和Bax 是一对正负凋亡调节基因，Bcl-2可抑制PTP 的开放从而抑制凋亡因子的释放和阻止凋亡的发生，而Bax，Bad，Bak 等作用恰恰相反，它们促进PTP 开放，从而促进凋亡因子释放。细胞中的Bax 蛋白可自身形成同源二聚体，并易与Bcl-2蛋白形成异源二聚体复合物，从而使Bax 失活。Bcl-2 表达相对增多时，Bcl-2/Bax 二聚体增多，消除Bax 的促凋亡效应，而Bax 表达相对增多时Bax/Bax同源二聚体增加，促凋亡作用上调。Duan［9］用不同浓度的Hcy 干预HUVEC 24h，发现Hcy 可以上调Bax 的表达，下调Bcl-2 的表达;Tyagi［5］培养鼠心微血管内皮细胞，通过cDNA 芯片检测发现，Hcy 使mRNA 水平的Bcl-2/Bax 比值下降，激活caspase9、3，进而引起细胞凋亡。

我们的研究发现，Hcy 对BMVECs 的生长有明显的抑制作用，可以造成细胞死亡。并且干预组BMVECs 的Bcl-2 mRNA 于处理后0～18h 呈持续降低趋势，而Bax mRNA 基本呈增高趋势，Bcl-2/Bax比值降低。此结果提示，Hcy 可能通过抑制Bcl-2 基因表达，促进Bax 基因表达，使Bcl-2/Bax 比值降低，致使细胞凋亡和存活信息平衡失调，从而最终诱导细胞调亡。可见Bcl-2 和Bax 基因在Hcy 诱导BMVECs 细胞凋亡过程中同样起着重要的作用。

Bcl-2 和Bax 基因的表达受核转录因子NF-κB及JNK 等途径的调控。有人［4，10，11］在观察Hcy 对平滑肌细胞及内皮细胞的影响时发现，Hcy 可以激活NF-κB，促进NF-κB 的核转位。用超氧负离子清除剂或I-κB 抑制剂可抑制Hcy 诱导的IKK 激活和NF-κB 激活［12］。我们在蛋白质水平上检测到，Hcy干预后不同时间点脑微血管内皮细胞的NF-κB 的的表达，结果证实有NF-κB 核转位的变化:6h，NFκB 已经出现胞核内表达;12h 时达高峰，细胞核着色明显;18h 时，这一现象开始减弱。已知NF-κB 是能调节多种炎症和免疫基因表达的一种重要的转录调控因子，它在相当广泛的病理生理过程中起调控作用，其中包括细胞凋亡现象。现有的部分实验研究表明，NF-κB 激活能保护细胞免于凋亡，而另一些研究中则发现，NF-κB 能促进凋亡基因的表达。可见NF-κB 的激活在细胞凋亡中的调控作用是多层次多方面的，这可能与研究细胞的种类及所处应激环境不同有关。本研究中观察到，随着NF-κB 的激活，Bcl-2 mRNA 于处理后0-18 h 呈持续降低趋势，而Bax mRNA 转录水平呈增高趋势，提示在Hcy 致内皮细胞损伤的过程中，NF-κB 有可能参与了Bc1-2 和Bax 基因介导的细胞凋亡途径。

［1］Alkhoury K，Parkin SM，Homer-Vanniasinkam S，et al.Chronic homocysteine exposure upregulates endothelial adhesion molecules andmediates leukocyte:endothelial cell interactions under flow conditions［J］.Eur J Vasc Endovasc Surg，2011，41(3):429－435.

［2］Dionisio N，Jardín I，Salido GM，et al.Homocysteine，intracellular signaling and thrombotic disorders［J］.Curr Med Chem，2010，17(27):3109－3119.

［3］Zakeri Z，Lockshin RA.Cell death:history and future［J］.Adv Exp Med Biol，2008，615:1－11.

［4］Austin RC，Lentz SR，Werstuck GH.Role of hyperhomocysteinemia in endothelial dysfunction and atherothrombotic disease［J］.Cell Death and Differentiation，2004，11:56－64

［5］Tyagi N，Ovechkin AV，Lominadze D，et al.Mitochondrial mechanism of microvascular endothelial cells apoptosis in hyperhomocysteinemia［J］.J Cell Biochem，2006，98(5):1150－1162.

［6］Kerkeni M，Tnani M，Chuniaud L，et al.Comparative study on in vitro effects of homocysteine thiolactone and homocysteine on HUVEC cells:evidence for a stronger proapoptotic and proinflammative homocysteine thiolactone［J］.Mol Cell Biochem，2006，291(1－2):119－126.

［7］Li L，Hu BC，Gong SJ，et al.Homocysteine-induced caspase-3 activation by endoplasmic reticulum stress in endothelial progenitor cells from patients with coronary heart disease and healthy donors［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2011，75(7):1300－1305.

［8］Rasola A，Bernardi P.Mitochondrial permeability transition in Ca2+-depen-dent apoptosis and necrosis［J］.Cell Calcium，2011，50(3):222－233.

［9］Duan J，Dai S，Fang CX，et al.Phytoestrogen alpha-zearalanol antagonizes umbilical vein homocysteine-induced imbalance of nitric oxide/endothelin-1 and apoptosis in human endothelial cells［J］.Cell Biochem Biophys，2006，45(2):137－145.

［10］Au-Yeung KK，Woo CW，Sung FL，et al.Hyperhomocysteinemia Activates Nuclear Factor-kB in Endothelial Cells via Oxidative Stress［J］.Circ Res，2004，94:28－36.

［11］Lin CP，Chen YH，Chen JW，et al.Cholestin(Monascus purpureus rice)inhibits homocysteine-induced reactive oxygen species generation，nuclear factor-kappaB activation，and vascular cell adhesion molecule-1 expression in human aortic endothelial cells［J］.J Biomed Sci，2008，15(2):183－196.

［12］Au-Yeung KKW，Woo CWH，Sung FL，et al.Hyperhomocysteinemia Activates Nuclear Factor-κB in Endothelial Cells via Oxidative Stress［J］.Circ Res，2004，94:28－36